传染性法氏囊病超强病毒株VP2基因原核表达及其免疫原性检测

为检测传染性法氏囊病超强毒株(vvIBDV)重组VP2蛋白的免疫原性,本研究利用RT-PCR方法扩增vvIBDV的结构蛋白VP2基因,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-VP2。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白约69 ku,并以包涵体形式存在。表达的重组蛋白经纯化后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明制备的血清效价在1∶5 120以上,表明vvIBDV VP2具有良好的免疫原性,为建立vvIBDV的ELISA检测方法提供了试验依据。

我国部分地区A2dB1型传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定及序列分析

为持续了解传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant infectious bursal disease virus,nVarIBDV)在我国流行情况,研究收集2021—2022年6个主要养禽地区疑似传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)鸡病料,采用RT-PCR进行检测,并对11株IBDV代表毒株的基因组双节段代表区段VP2-HVR和VP1-B-marker进行基因测序及序列分析。结果显示:所检测病料的IBDV阳性率为20.65%(19/92),其中11株IBDV代表毒株均为A2dB1型nVarIBDV。研究表明,nVarIBDV在我国主要养禽地区仍持续流行,而且出现了值得注意的新的突变位点,有必要进行持续的IBDV流行病学监测。

一株麻鸡传染性法氏囊病毒新型变异株的分离鉴定

近几年,鸡传染性法氏囊病毒新型变异株在我国广泛流行,主要发生于肉鸡,其致病力弱、隐蔽性强但能造成法氏囊严重萎缩。本研究从山东济宁地区临床出现法氏囊萎缩的发病麻鸡中采集法氏囊病料,接种SPF鸡胚进行病毒分离,通过RT-PCR方法进行病毒鉴定,将分离毒株回归SPF鸡进行致病性试验,同时对其主要抗原基因VP2进行进化分析。结果发现,该毒株能致死鸡胚;对其VP2基因进行测序比对和进化树分析发现,其与近几年的新型变异株基因序列的进化关系较近,同源性为96.1%~99.2%;人工感染SPF鸡第7 d法氏囊即出现较为明显的萎缩,第14 d萎缩更为明显,囊体比显著小于对照组(P<0.01)。本研究分离到的麻鸡源传染性法氏囊病毒JN22株属于新型变异株,能导致SPF鸡法氏囊显著萎缩。

2株肉鸡源传染性法氏囊病病毒的分离鉴定

为了解传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的流行情况,监测其优势流行毒株的基因型变化,对疑似IBDV感染的临床病料进行检测,通过有限稀释法对IBDV毒株进行分离纯化,对分离毒株进行遗传进化分析和致病力分析。结果显示:从阳性病料中成功分离得到2株纯净的IBDV毒株;遗传进化分析结果显示,HN-2022-1株属于经典株,其VP2蛋白高变区具备经典毒株分子标志;AH-2022-1株属于HLJ0504样超强毒株,存在节段重配现象,其VP2蛋白高变区除具备超强毒株分子标志外,还具备经典株、早期变异株分子标志。此外,AH-2022-1株在VP2蛋白第一亲水区还发现了3处从未报道过的氨基酸突变,这导致第一亲水区的亲水性下降,可能引起该毒株发生毒力变化。致病力分析结果显示,2株IBDV均可引起严重的法氏囊萎缩,发病率100%,但仅AH-2022-1株可引起20%死亡率,与HLJ0504样株报道的60%~80%死亡率并不一致。提示:IBDV处于不断进化中,IBDV经典毒株仍在我国持续流行,研究结果为我国IBDV感染的防控提供了一定参考。

传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量RT-PCR检测方法的建立

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量RT-PCR结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规RT-PCR的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

鸡传染性法氏囊病病毒VP5的原核表达、多抗制备及初步应用

传染性法氏囊病(infectious bursal disease virus,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明:试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。

肉鸡源传染性法氏囊病新型重排毒株的分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确云南某肉鸡场疑似传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染病例的病原类型及分子特征,以了解IBDV新型重排毒株在肉鸡中的流行情况、分子进化趋势,为制定有效的传染性法氏囊病(IBD)防控和疫苗选用策略提供参考依据。[方法]对疑似IBDV感染的病鸡法氏囊进行研磨处理后,采用巢式RT-PCR进行检测,后将IBDV阳性的法氏囊组织悬液接种于9日龄SPF鸡胚并进行病毒分离,对病毒的vVP2和VP1-b基因扩增并进行遗传变异分析。[结果]成功分离出一株新型IBDV重排毒株(命名为YN-YX221110),接种9日龄SPF鸡胚后,胚体整体呈现弥漫性出血,头、颈以及背部皮肤有出血点。基于vVP2基因序列,分离株YN-YX221110与新型变异株(nvIBDV)参考株的核苷酸相似性最高,为93.2%~97.9%,分离株YN-YX221110的vVP2基因222A特征性氨基酸位点与UK661、HK46等超强毒株(vvIBDV)参考株相同,249K、256V、279N、284A、294L、299S等位点与新型变异株(nvIBDV)参考株中的SHG19相同;在基于vVP2基因的遗传进化树中,分离株YN-YX221110与GX-QZ191002、SHG19等nvIBDV参考株聚为一支,属于A2d分支。基于VP1-b基因序列,分离株YN-YX221110与参考株中的经典毒株(cIBDV)类似株核苷酸相似性最高,为97.8%~98.4%,分离株YN-YX221110的vVP2基因特征性氨基酸位点240D、242D、287T、390L和393E与致弱毒株(attIBDV)参考株中的B87、Gt相同;在基于VP1-b基因序列的系统发育进化树中,分离株YN-YX221110与参考株Gt、B87和CEF94等cIBDV类似株中的attIBDV聚为一支,属于B1a分支。分离株YN-YX221110基因型为A2dB1a。[结论]成功分离得到肉鸡源IBDV分离株YN-YX221110,其A片段来源于nvIBDV,B片段来源于cIBDV类似株中的attIBDV,为新型IBDV重排毒株。

非编码RNA在传染性法氏囊病病毒感染中的研究进展

传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBD virus, IBDV)引起的急性、高度传染性和免疫抑制性禽类疾病。近年来,随着新型变异毒株的出现,IBDV仍然威胁着全球家禽养殖业的健康发展,宿主和IBDV之间的“战役”似乎永不停息。因此,迫切需要制定一种更全面和更有效的策略来控制该疾病,而深入了解IBDV与宿主之间的相互作用,将有助于开发新型疫苗。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNAs)是一类丰富的不编码蛋白质的RNA分子,其中包括微小RNA(microRNAs, miRNAs)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)和环状RNA(circular RNA,circRNAs)。近年来,研究发现ncRNAs广泛参与IBDV与宿主的相互作用过程,在IBDV感染中发挥重要的调控作用。本文阐述了宿主miRNAs、lncRNAs和circRNAs在IBDV感染中的作用,以期为IBDV的感染与致病机制研究提供理论参考和新思路。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究

为研究鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)细胞嗜性改变的分子基础,本研究通过定点突变、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术,以vvIBDV HLJ-0504株为骨架构建了两组感染性克隆,并借助已建立的反向遗传操作技术进行病毒拯救。IFA检测、电镜观察及RT-PCR鉴定均显示:Q253H/A284T双点突变的pCAGGHLJ0504A889/980HRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF1细胞成功拯救出重组病毒(rHLJ0504HT),而未进行双点突变的pCAGGHLJ0504AHRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染组未获得重组病毒。上述结果表明,双点突变Q253H/A284T能使vvIBDV HLJ-0504适应非允许细胞CEF,但未进行Q253H/A284T双点突变的vvIBDV HLJ-0504不能感染非允许细胞CEF,因此,该研究表明VP2的Q253H/A284T两个氨基酸突变是vvIBDV细胞嗜性改变的分子基础。

传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价

【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株(vaIBDV)VP2蛋白原核表达质粒,并明确VP2蛋白的免疫原性,为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。【方法】从IBDV新型变异株(BZ)中扩增VP2基因片段,亚克隆至pET-28a(+)载体上构建重组原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡,通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。【结果】在25℃下以IPTG进行诱导表达,获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表达,大小约40 kD,且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应,其琼扩效价可达1∶32;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好,安全性高,无免疫引起的不良反应,剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8,而血清抗体效价均在1∶20000以上,表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应,抗体阳性率达100%;使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况,结果显示免疫组鸡只均未发病,其法氏囊也无明显萎缩现象,即免疫保护率达100%。【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达,且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好,能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果,为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87在DF-1细胞和Vero细胞感染性研究

为比较传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗株B87对DF-1细胞和Vero细胞易感性,对比了IBDV B87株感染两种细胞后的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒基因组dsRNA、半数组织感染量(median tissue culture infective dose,TCID 50)水平、病毒载量及VP2基因表达水平。结果显示,IBDV B87株感染后,DF-1细胞CPE程度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒基因dsRNA荧光密度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒载量荧光密度高于Vero细胞,且DF-1细胞中病毒滴度(105.423±0.03296 TCID 50/0.1 mL)极显著高于Vero细胞中病毒滴度(102.592±0.03428 TCID 50/0.1 mL,P<0.01),VP2基因表达量显著高于Vero细胞(P<0.05)。说明IBDV B87株对DF-1细胞的感染性高于Vero细胞。

一株鸡传染性法氏囊病毒变异株的鉴定与致病性

近日,在福建省南平市某鸡场发现一株新的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)流行株,并将其命名为IBDV-FJ02.为了明晰IBDV-FJ02株遗传变异情况和临床致病特征,进行了A节段基因组序列和特征性氨基酸位点的分析、基于A节段和B节段的新型基因型分类以及对无特定病原体(SPF)鸡致病性的研究,旨在为鸡传染性法氏囊病的防治提供依据.结果显示:IBDV-FJ02株A节段核苷酸序列与早期变异株E的同源性最高,达95.6%,与中国变异株SHG558在同一分支上;IBDV-FJ02株VP2-4-3蛋白氨基酸序列第222位氨基酸为T,第249位为K,第318位为D,参考变异株中仅GLS、E与其一致,位点N^(213)、T^(222)、K^(249)、 D^(318)、E^(323)均符合变异株的特征.根据新型基因型分类方案,显示IBDV-FJ02株属于A2dB1基因型,即IBDV新型变异株类群.致病性测定结果显示:IBDV-FJ02株感染3周龄SPF鸡并不会导致感染鸡只死亡,在感染后21 d内,主要引起鸡只法氏囊的严重萎缩和脾脏的轻微肿大.上述结果表明,IBDV-FJ02株是一种IBDV新型变异株,具有明显的IBDV变异株致病特点.

传染性法氏囊病病毒新型变异株的分离和鉴定

为调查我国部分地区规模化养鸡场传染性法氏囊病病毒(IBDV)新型变异株流行现状,参考IBDV VP2蛋白高变区序列设计Taqman-MGB探针和引物,建立IBDV快速检测方法,利用其检测来自河北邯郸、江西宜春、重庆7家大型育雏场送检法氏囊病料,并对阳性病料进行病毒分离、测序和进化分析。成功建立了一种兼顾IBDV鉴定和测序分型的荧光定量PCR方法,该方法在10^(1)~10^(8)拷贝/μL范围内具有良好线性关系(相关系数为0.9963),扩增效率良好(扩增效率为109%),对其他常见病毒无扩增,最低检测限为1.25×10^(1)拷贝/μL;利用该方法检测邯郸地区4家育雏场送检样品均为阳性,测序均为IBDV新型变异株,采用鸡胚自阳性样品中分离到3株IBDV(T2021与T2022、J2021);对分离株A节段测序发现,3株IBDV分离株均属国内新型变异株,与国内新型变异株SHG19氨基酸同源性为100%,核苷酸同源性为98.0%~98.6%,T2021与T2022、J2021分属两个进化分支。建立了一种IBDV快速检测方法,发现IBDV国内新型变异株在我国部分地区仍存在。

超强传染性法氏囊病病毒株宿主保护抗原的分子特征

为了探索超强传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）株毒力增强的原因，采用反转录－聚合酶链反应技术，从中国广东、福建分离到的３株超强ＩＢＤＶ毒株中扩增到编码ＶＰ２蛋白的ｃＤＮＡ基因片段，并对ＶＰ２基因的高可变区进行了序列测定。序列分析和聚类分析表明，３株超强毒株与欧洲超强毒株非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。将超强毒株ＶＰ２高可变区的氨基酸序列与其他血清Ⅰ型毒株进行比较，发现除了具有一般ＩＢＤＶ强毒株的分子特征之外，所有超强毒株在２２２、２５６、２９４和２９９位上的氨基酸均相同，分别为Ａ、Ⅰ、Ⅰ和Ｓ，与其他毒株均不相同。而２２２、２９４和２９９位上的特征性氨基酸使超强毒株ＶＰ２中诱导中和抗体的抗原决定簇的构象发生细微变化，从而导致毒力增强。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性

鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株GX8/ 99,系 1999年从广西一自然发病鸡群采集到。用原始病鸡法氏囊悬液连续 3次人工感染SPF鸡后 ,再取其法氏囊制备悬液 ,分装 ,在 - 70℃保存。以此悬液经卵黄囊接种 10日龄SPF鸡胚 ,测定鸡胚的半数致死量 (ELD50 )。随着鸡的日龄和接种剂量的不同 ,其致死率有很大差异。对 2 8～ 30日龄SPF鸡 ,病毒接种量为 2 0 0个ELD50 时 ,感染后 7日内死亡率最高可达 73%～ 90 5 % (11/ 15和 19/ 2 1) ;感染量为 2 0个ELD50 时 ,死亡率亦可达 5 3%～ 92 % (8/ 15和 2 3/ 2 5 )。以 5 0 0个ELD50 感染 2 8～ 10 4日龄的SPF鸡 ,死亡率均在 5 5 1%～ 6 7 2 % ;甚至 113～ 12 0日龄的SPF鸡 ,感染后仍有 10 %～ 15 %致死率。但 12 8日龄的SPF鸡感染后既不引起死亡也不表现任何症状 ,但抗体全部转阳。人工接种发病死亡的鸡 ,其法氏囊的出血程度也随感染量和年龄而异。 5 0日龄鸡接种 2 0 0 0个ELD50 后 ,死亡的鸡 10 0 % (12 / 12 )法氏囊严重出血 ;而 4 0日龄鸡感染 2 0 0个ELD50 后 ,死亡鸡中仅 17% (3/ 18)发生出血。在 2、3、4周龄带有母源抗体的商品代蛋鸡 ,以 2 0 0 0个ELD50 病毒接种后 ,只引起 10 % (2 / 2 0 )、35 % (7/ 2 0 )和 35 % (7/ 2 0 )的死亡率。但在

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV-VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120h,脑内致病指数(ICPI)分别为0.4和0.36,静脉内致病指数(IVPI)均为0;接种后72～96h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100%保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90%以上。【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病-新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。

2株鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离鉴定

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株 (vv IBDV) He B- lf和 He B- bd接种 SPF鸡 ,36 h后接种鸡开始发病 ,发病率为 10 0 %,死亡率为 5 0 %以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化 ,如肌肉、心脏、腺胃出血 ,法氏囊水肿或呈“紫葡萄”样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该两分离物为超强毒株 ,从而证明河北省鸡群中存在不同于经典 IBDV的超强毒株。

传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504全基因组克隆及其新特征分析

为了解传染性法氏囊病病毒(IBDV)HLJ-0504株的分子生物学特征,本研究利用融合PCR技术获得HLJ-0504株全基因组序列。核苷酸和推导氨基酸序列遗传演化分析发现,HLJ-0504A节段位于IBDV超强毒的分枝上,而B节段则介于超强毒株和减毒株之间,形成一个独立分枝,属于一株新的自然重组病毒。VP2抗原性预测分析表明,HLJ-0504株VP2第Ⅰ亲水区中的氨基酸发生突变(D212N),该突变可能导致了HLJ-0504株抗原性发生漂变。本实验结果为深入研究IBDV的分子特征奠定了基础。

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) 5 2 /70株基因组序列 ,设计并合成了 1对特异扩增 IBDVVP2基因的引物。以 IBDV超强毒 ( vv IBDV) GZ株基因组为模板 ,利用 RT-PCR技术扩增出了 1 .5 kb的c DNA产物 ,将 VP2基因克隆于 p UC1 1 9质粒上 ,得到重组 p UC1 1 9质粒。对 VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明 ,GZ株与欧洲超强毒株 UK6 6 1非常相似 ,而与经典强毒株。

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒 (vvIBDV)Gx株进行培育 ,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱 ,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析 ,从而揭示vvIBDVGx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明 ,细胞毒在第 8代以前 ,VP5基因序列没有改变 ,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达 98%以上 ;细胞毒第 9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变 ;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu_1氨基酸序列同源性达 99% ;细胞适应毒传至 2 0代 ,其VP5基因序列不再改变。从而说明 。