一株虹鳟源传染性胰腺坏死病病毒的分离与鉴定

为明确引起四川石棉某养殖场饲养的虹鳟患病死亡的病原体,实验对自然发病虹鳟进行大体病变观察并对其病原体进行分离,通过人工感染实验及多重RT-PCR鉴定确定病原体WZ160509,并对病原体的主要结构蛋白VP2进行扩增分析,同时对病变组织进行组织病理学观察。结果显示,患病鱼主要临床症状表现为体表发黑,腹部膨大,挤压腹部可见肛门喷射淡黄色黏液便;剖检可见肝脏、肾脏苍白;肠道内无食物,内积黄色黏液。将患病虹鳟组织匀浆液无菌接种虹鳟鱼生殖腺细胞系(rainbow trout gonad cell line,RTG-2)细胞,盲传3代均出现典型的细胞病变。人工感染实验显示死亡率高达90%,并出现与自然患病鱼相同的症状。多重RT-PCR检测发现,自然发病鱼、人工感染鱼以及病变RTG-2细胞均为传染性胰腺坏死病病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)阳性,其主要结构蛋白VP2基因与美国分离株基因组1型聚为一支,且同源性分析表明,WZ160509-VP2与IPNV-VP2(AY026345)的同源性最高,序列一致性为95.8%。组织病理学观察显示,患病鱼胰腺细胞空泡变性,坏死;肝细胞空泡变性,坏死;肾小球轻度炎症,毛细血管通透性增加,肾小囊腔内有红色絮状蛋白类物质渗出,肾小管上皮细胞空泡变性。研究表明,从该养殖场患病虹鳟中分离到的病毒为IPNV。

虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病重组腺病毒载体的构建

传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病是以感染鲑科鱼类为主的两种传染病。为克隆传染性造血器官坏死病病毒IHNVG基因和传染性胰腺坏死病病毒IPNVVP2基因,并构建其重组腺病毒载体。利用RT-PCR方法分别扩增出IHNVG基因和IPNVVP2基因,通过多基因片段同源重组技术将IHNVG基因和IPNVVP2基因克隆到pAdTrack-CMV载体上,经过线性化后与pAdEasy-1载体在BJ5183菌体内同源重组,构建出重组腺病毒质粒,经PCR及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,再经PacⅠ线性化后用于转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒。通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达来监控重组腺病毒的复制情况,用western blot法分别检测糖蛋白(G蛋白)和VP2蛋白的表达,并测定重组病毒的滴度。结果显示,克隆出的IHNVG基因和IPNVVP2基因总长度为3036 bp。该病毒在HEK-293细胞中分别表达出蛋白分子质量约为58 kD和54 kD的产物,其滴度为1.0×10^(9.5)mL^(-1)TCID_(50)。结果表明,研究成功获得IHNVG基因和IPNVVP2基因重组腺病毒,该病毒在HEK-293细胞中滴度较高,能够稳定表达。研究结果为下一步研发传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联疫苗奠定了基础,并为进一步防控传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病提供了参考。

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明,表达的VP3蛋白与天然的IPNVVP3蛋白一样具有相同的抗原性。试验利用原核表达系统成功地高效表达了IPNVVP3蛋白,融合蛋白以可溶性形式存在,并制备了高效价的抗血清。

传染性胰腺坏死病毒VP2 COE蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免疫荧光鉴定结果显示,2株单抗均能特异性地识别IPNV。间接ELISA表明,2株单抗不与IHNV、VHSV、SVCV、HRV等病毒反应,说明获得的单抗具有高度的特异性。相加ELISA实验结果显示,2株单克隆抗体分别识别IPNV VP2蛋白上不同的抗原位点。应用间接免疫荧光方法对临床确定为患有IPN虹鳟肝组织进行检测,结果证实该2株单克隆抗体可用于后续实验。

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白在干酪乳杆菌的表面表达

为获得传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白在菌体表面表达,本研究将IPNV VP3基因定向插入乳酸杆菌表面表达型载体pPG1,构建的重组质粒pPG1-VP3电转化干酪乳杆菌,获得了重组干酪乳杆菌表达系统pPG1-VP3/Lactobacillus casei393。经1%糖诱导表达后,SDS-PAGE和western blot检测表明,有约31ku蛋白得到了表达,其大小与理论值相符;诱导表达的菌体进行间接免疫荧光试验表明,重组蛋白在菌体表面获得了表达。该病毒VP3蛋白在乳酸菌的表面表达为进一步探讨传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白免疫原性及相关功能奠定了基础。

传染性胰腺坏死病毒VP3基因的分段表达及其抗原表位区域分析

采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒（IPNV）VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1-VP3（L1）、pET32a-VP3（L2）、pGEX-6P1-VP3（L3）和pGEX-6P1-VP3（L4）;将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为32 kD、26 kD、30 kD和31 kD的目的蛋白。经Western-blo-ting分析,4段目的蛋白中,只有VP3（L1）和VP3（L4）基因片段所表达的融合蛋白能与IPNV阳性血清反应,说明VP3蛋白的免疫优势区域集中在该蛋白的1~70和143~206氨基酸之间。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。本实验为进一步精确定位VP3蛋白抗原表位奠定了基础。

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统构建

根据传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白的全基因序列,设计并合成引物,以IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养毒提取的核酸为模板,对传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统进行了构建研究。结果显示:进行RT-PCR扩增得到截短的VP3基因约615 bp目的片段,将其克隆到pMD18-T Simple载体,经酶切、PCR扩增和序列测定后显示目的片段正确;将目的片段分别亚克隆到乳酸菌细胞表面表达型载体和分泌表达型载体,电转化于干酪乳杆菌,获得了阳性重组菌株。结果表明,通过本实验方法可构建表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统,为实现IPNV VP3蛋白在乳酸菌中的表达及免疫原性研究奠定了基础。

虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的分离与鉴定

1989年,从我国西北地区甘肃省某养殖场虹鳟稚鱼中新分离到一株传染性胰腺坏死病毒,简称IPNV-CI株。其形态学特性、理化特性和生物学特性与国外IPNV的相关报道基本一致。通过血清中和试验和ELISA检测,新分离的病毒可鉴定为IPNV-Sp株。IPNV-CI株病毒在CHSE、RTG-2及RL等细胞上增殖良好,且可引起严重的细胞病变,病毒滴度可达10^(8·25) TCID_(50)/0.1ml。病毒颗粒呈二十面体、无囊膜、有92个壳粒,直径约为50～60nm,属RNA病毒。病毒对热比较稳定,对酸稳定,对脂溶剂不敏感。新分离病毒回归虹鳟稚鱼能引起与自然发病相同的症状,主要表现为狂游、翻转、腹部膨大;眼球突出,部分稚鱼体色变黑。稚鱼接种病毒后第7天死亡达到高峰。死亡率为68.66％。从回归试验病死稚鱼病料中重新回收到了病毒。

抗传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。

虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒反转录聚合酶链反应的建立

虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒反转录聚合酶链反应的建立刘兴发李红卫钟志宏侯顺利臧荣鑫赵卫平（兰州军区生物医学研究所兰州７３００２０）传染性胰腺坏死是由传染性胰腺坏死病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐａｎｃｒｅａｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＰＮＶ）引起的鲑...

虹鳟传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)的初步研究

山西省虹鳟试验场用从日本引进的鱼卵孵化的虹鳟稚鱼暴发流行病,死亡率高达90％以上。经组织培养分离到病毒,能在鲑鳟细胞系中产生细胞病变,形成直径0.5—1mm的空斑。感染健康虹鳟稚鱼能复制出与天然发病相同的症状和死亡率。病毒对氯仿不敏感,耐酸、耐热。病毒负染后电镜观察为直径55—65mm的二十面体颗粒,无囊膜,具单层衣壳。经血清学鉴定为传染性胰脏坏死病病毒(Infectious pancreatic necrosis virus简称IPNV)在血清学交叉中和反应中与抗IPN-Sp株的抗血清有强烈的交叉反应,提示可能为IPN-Sp株。

传染性胰脏坏死病疫苗的研究进展

传染性胰脏坏死病(infectious pancreatic necrosis,IPN)是由传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)引起的死亡率高达90%的鲑鳟鱼病毒性疾病。该病分布广泛,流行于欧洲、美洲、非洲以及亚洲等多个地区;传染性极强,病原极其稳定,幸存的鱼苗作为病毒携带者具有传染性,对世界鲑鳟鱼养殖业造成了巨大的经济损失。接种疫苗是防控该病毒病的最有效方式,但是,目前我国没有商业化的IPN疫苗。由于毒株存在变异及生物安全隐患,国外商业化的IPN疫苗无法直接引进应用。本文总结了IPN疫苗的研究进展,可为我国IPN的有效防控提供参考。

实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立

[目的]建立Taqman探针荧光定量RT-PCR检测传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)的方法。[方法]选取IPNV病毒的基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物与探针。以梯度稀释的含有IPNV目的扩增片段的质粒作为标准品,探索定量RT-PCR反应条件。[结果]当标准品浓度在102～106 copies/μl之间时,标准品浓度(X)与Ct的关系为Ct=-3.426 lgX+4.481,相关系数R2为0.999 8。该法对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、鲤春病毒血症病毒(SVC)和流行性造血器官坏死病病毒(EHNV),草鱼呼肠孤病毒(GCRV),大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)和虹鳟的核酸都没有扩增反应。[结论]该检测方法灵敏度高,特异性好,可用于鱼类传染性胰脏坏死病病毒的快速定量检测。

传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】成功克隆了IHNV G蛋白基因,该基因长度为1 527bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G,诱导表达出约76ku的产物,与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示,所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示,小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统,重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。

鱼类传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的酵母表面展示

糖蛋白(glycoprotein,G)是鱼类传染性造血器官坏死病毒的主要表面抗原,是病毒检测及疫苗研制的主要靶基因。为了对其进行酵母表面展示,本研究利用本实验室保存的含有IHNV-Sn1203毒株G基因的质粒为模板,PCR扩增富含抗原表位的糖蛋白基因片段后,连接酵母表面展示载体p YD1,构建重组质粒p YD1-G。将p YD1-G转化酿酒酵母EBY100细胞后,利用半乳糖诱导G蛋白的表达。利用细胞免疫荧光、Western Blotting及流式细胞仪检测酵母表面G蛋白的表达情况。细胞免疫荧光结果显示,转化了p YD1-G重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性荧光;Western Blotting结果显示,经半乳糖诱导后G蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;流式细胞仪检测结果表明,随着半乳糖诱导时间的增加,G蛋白的表达量随之增加,并在诱导48 h时达到峰值。以上研究表明G蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达,本研究为以酵母为活载体的新型口服疫苗的研制奠定了基础。

传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制

为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。

传染性脾肾坏死病毒、ConA和LPS对体外鳜的头肾淋巴细胞转化的影响

采用 ＷＴＴ颜色反应法研究传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）、伴刀豆球蛋白 Ａ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｌｉｎ Ａ，ＣｏｎＡ）和脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）在离体状态下对健康和ＩＳＫＮＶ感染后存活３０ｄ或６０ｄ的鳜的头肾淋巴细胞转化的影响。结果表明，ＣｏｎＡ和ＬＰＳ能促进健康级头肾淋巴细胞的转化，而对感染后存活３０ｄ或６０ｄ的鳜头肾淋巴细胞没有作用；纯化的ＩＳＫＮＶ对健康鳜头肾淋巴细胞没有促进淋巴细胞转化的作用，但对ＣｏｎＡ的作用有抑制，对感染后存活的３０ｄ或６０ｄ的鳜头肾淋巴细胞，纯化的ＩＳＫＮＶ有一定的促进转化的作用。感染存活的鳜头肾中有对ＩＳＫＮＶ的免疫记忆性Ｔ细胞。另外，用建立的ＩＳＫＮＶ ＰＣＲ检测方法对健康和ＩＳＫＮＶ感染后存活的鳜组织进行了检测，结果显示，健康鳜为阴性，而ＩＳＫＮＶ感染后存活的鱼，头肾、后肾、脾脏和部分鱼的心脏为阳性。ＩＳＷ在鳜体内形成潜伏感染。

鳜鱼传染性脾肾坏死病和弹状病毒病二联灭活疫苗毒种及种子批的研究

【目的】建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。【方法】以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1~F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对鳜鱼的毒力。PCR扩增ISKNV的主衣壳蛋白(MCP)基因、RT-PCR法扩增SCRV G蛋白基因序列,检测ISKNV和SCRV毒种的特异性。对F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒种进行细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒(RANA)和神经坏死病毒(NNV)检测,检验毒种的纯粹性。分别将F1、F5和F10代ISKNV、SCRV病毒液用甲醛灭活后制备灭活疫苗,免疫鳜鱼21 d后攻毒,连续观察14 d,待鱼体稳定后统计死亡率并计算免疫保护率(RPS)。将ISKNV和SCRV毒种湿毒保存于-80℃冰箱,每6个月取3支检测病毒滴度,以确定毒种的保存期。【结果】各代次毒株感染CPB细胞后产生的CPE形态及病变速度基本相同,SCRV滴度为10^(8.58)~10^(8.875) TCID_(50)/mL,ISKNV滴度为10^(7.38)~10^(7.625) TCID_(50)/mL。F1、F5和F10代ISKNV按10^(4) TCID_(50)/mL、SCRV按10^(6.5) TCID_(50)/mL对鳜鱼攻毒(每尾0.1 mL),致死率均超过90%。ISKNV和SCRV各代次毒种可分别扩增出1300 bp的MCP基因和1500 bp的G基因,特异性良好。ISKNV、SCRV毒种无细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒和神经坏死病毒污染。各代次病毒灭活疫苗对鳜鱼安全有效,免疫保护率ISKNV可达92%以上,SCRV可达84%以上;湿毒-80℃保存,保存期为36个月。【结论】10代以内ISKNV和SCRV的生物学特性稳定,可用于鳜鱼ISKNV和SCRV二联灭活疫苗的制备与检验。