一株传染性软化病病毒的分离和鉴定

病毒性软化病是一种严重影响蚕业生产的流行病，其病原为家蚕传染性软化病病毒（Bombyx mori infectiousflacherie virus，BmIFV）。本实验室在浙江省收集到具有软化病症状的家蚕幼虫，并分离纯化获得一株病毒。电镜观察到病毒粒子为直径26nm左右、无包涵体的球状颗粒。病毒添食四龄起蚕和五龄起蚕，分别在3～4d和5～7d出现明显症状和病变。纯化病毒SDS-PAGE条带与BmIFV蛋白相仿。病毒核酸鉴定为RNA，并可用套式RT-PCR扩增出特异性片段，测序发现片段序列和BmIFV日本坂城株的同源性为99．5％。由此可确定该病毒为BmIFV，这是我国首次分离到该病毒，暂命名为BmIFV-CHN001。

传染性软化病病毒感染家蚕中肠上皮细胞的免疫电镜观察

家蚕传染性软化病病毒(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV)专一地侵染家蚕中肠上皮组织,造成中肠上皮细胞的超微结构发生病变,在染毒家蚕的中肠杯形细胞内形成特异性小泡体和电子稠密体等特异性结构。电镜观察显示,在感染早期,微绒毛膜、线粒体附近及相邻两个细胞的细胞膜和内质网中较易发现胶体金颗粒(10 nm)的吸附;其后在微绒毛中间和细胞质中,以及内质网和特异性小泡体的界限膜附近出现或较多存在,但线粒体和特异性小泡体的内部未见金颗粒的吸附。因此可以认为:家蚕传染性软化病病毒主要在染毒细胞的各细胞器膜附近出现。

家蚕传染性软化病病毒(桐乡株)VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒(Bombyx moriinfectious flacherie virus,BmIFV)BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。

家蚕传染性软化病病毒荧光定量PCR检测技术及浙江省流行病学调查

荧光定量PCR检测技术可实现对病原微生物的早期或快速检测,根据家蚕传染性软化病病毒(BmIFV)的RNA序列,设计了具有物种特异性的引物和探针,建立了荧光PCR检测BmIFV的方法。将设计的引物和探针同时对BmIFV、家蚕微孢子虫(Nb)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕浓核病病毒(BmDNV)和桑叶进行特异性验证,结果显示只有BmIFV得到阳性结果。该方法对含BmIFV目标片段质粒的检测灵敏度达10^(-3)ng/μL,对目标病毒的检测灵敏度为3.4ng/μL。同时,对浙江省嘉兴市秀洲区、湖州市南浔区、嘉兴市桐乡市、嘉兴市海宁市、杭州市淳安县5个蚕区家蚕感染BmIFV情况进行了流行病学调查,结果显示这5个蚕区BmIFV感染率约为3.6%,为浙江省家蚕传染性软化病防治提供参考。

家蚕传染性软化病病毒的冷冻电子显微镜三维重构

应用冷冻电子显微镜三维重构技术获得了家蚕传染性软化病病毒(Infectious flacherie virus,IFV)衣壳的三维立体结构.重构最终结果使用了5047个病毒粒子的数据.FSC曲线显示该重构结果的分辨率为18?.IFV的衣壳直径为302.4?,遵循拟T=3(P=3)二十面体对称.衣壳为单层,厚度15?,表面光滑致密,无明显突起或凹陷,无孔洞贯穿.将IFV衣壳结构与昆虫的类小RNA病毒-蟋蟀麻痹病毒(Cricket paralysis virus,CrPV)以及人小RNA病毒-人鼻病毒14(human rhinovirus14,HRV14)的衣壳进行比较,发现IFV衣壳结构与CrPV更为接近.与CrPV一样,IFV衣壳表面也缺少"Rossmann峡谷".同时预测了IFV结构蛋白VP2和VP3的肽链折叠拓扑结构,并对亚基在衣壳表面的分布位置进行了推测.