5种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究

为筛选抗牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的中药,本研究选取大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连,测定其对MDBK细胞的最大安全浓度,在此基础上通过计算各药物对病毒的抑制率分析上述中药对IBRV的直接杀伤作用、对IBRV黏附细胞的阻断作用和对IBRV在细胞内的抑制作用,确定上述中药对IBRV的有效抑制率;进一步,利用qPCR方法检测中药与IBRV作用后对MDBK细胞中细胞因子转录水平的影响。结果显示,连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草对MDBK细胞的最大药物安全浓度分别是3.125 mg/mL、3.125 mg/mL、0.780 mg/mL、1.560 mg/mL和0.780 mg/mL;大青叶对IBRV的直接杀伤作用最好,金银花对IBRV黏附细胞的阻断作用和对细胞内IBRV复制的抑制作用最好;鱼腥草可显著提高细胞中TNF-α、IL-2和IFN-γ的转录水平(P<0.001);大青叶可极显著提高细胞中IL-1β、IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的转录水平(P<0.001);黄连可极显著提高细胞中IL-1β的转录水平(P<0.001)。结果表明连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草均有抗IBRV作用,其抗病毒方式并不相同,本研究为抗IBRV中药的研发奠定基础。

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示:该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10^(4)和10^(3)copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%和93.33%,两种病原混合感染的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的IBRV和BVDV双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,为兽医临床快速诊断IBRV和BVDV提供了一种方便、快捷的分子生物学检测手段。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)在MDBK细胞上的培养条件优化

本试验旨在探索对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV HL-2株)敏感的细胞种类及其在相应细胞上的培养特性和培养条件。将IBRV HL-2病毒液接种不同传代细胞,结果表明MDBK细胞对IBRV HL-2株敏感,能产生明显的细胞病变。对各种条件进行优化,结果表明接种时间、接毒量、维持液血清含量、培养基种类均对收获的病毒液病毒含量有影响。通过优化,得出最佳培养条件如下:在细胞传代后24 h接种,弃掉营养液,加入含2%血清的MEM作为维持液,接入0.01感染复数(moi)的病毒液,接种后44±2h收获,所获得的病毒液病毒含量最高。

牛传染性鼻气管炎病毒gB ELISA抗体与中和抗体相关性分析

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是牛传染性鼻气管炎(IBR)的病原体,常引起流产和呼吸道感染等综合征,给养牛业造成了巨大经济损失。gB作为IBRV中最保守的抗原蛋白,是IBRV诊断的重要靶蛋白。为探究牛gB–ELISA抗体水平与VNT效价的相关性,本研究采用阻断ELISA和VNT两种不同的方法对某一牛场50份血清进行IBRV gB ELISA抗体检测和中和抗体测定。gB ELISA结果显示,阳性血清19份,阴性血清31份;中和抗体结果阳性17份,阴性33份。通过统计学相关系数分析,gB抗体阻断率和中和抗体效价值的相关系数为1.0,从而说明IBRV gB ELISA抗体和中和抗体呈较强的正相关。本研究为使用IBRV gB ELISA抗体水平评估牛群中IBRV抗体保护效果提供理论依据。

牛传染性鼻气管炎病毒gB基因原核表达与鉴定

为给后续牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)单克隆抗体制备、酶联免疫吸附试验等研究提供基础,采用PCR技术扩增IBRV gB基因主要抗原区序列(312~529 aa位置),构建原核重组表达质粒pET-32a-gB,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过对蛋白表达形式确认并对诱导剂(IPTG)浓度、诱导表达时间及诱导温度优化,表达并纯化获得gB重组蛋白,并对重组蛋白进行反应原性鉴定。结果显示:gB重组蛋白主要以包涵体形式表达,IPTG最佳诱导浓度为1 mmol/L,最佳诱导表达时间为6 h,最佳诱导温度为37℃;重组蛋白相对分子质量约60 ku,纯化后蛋白质量浓度为1.02 mg/mL;Western-blot鉴定发现,gB重组蛋白能被IBRV阳性血清特异性识别。结果表明,成功对IBRV gB基因进行体外原核表达与鉴定,为后期开展相应单克隆抗体制备等研究奠定了基础。

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的快速定量检测方法,本研究针对IBRV基因组gD序列保守区域设计特异性扩增引物,扩增的目的片段大小为105 bp,将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒标准品pMD-gD-IBRV,优化反应体系后,建立了快速检测IBRV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法特异性较强,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法敏感性高,对重组质粒标准品的最低检出限达4.8×10^(0)copies/μL,高于常规PCR方法;批内、批间重复性试验的变异系数均小于2%,表明该方法重复性良好;该方法检测的样本阳性率高于常规PCR方法,利用该方法检测牛场送检的106份临床样品,结果显示IBRV的阳性率为36.7%,常规PCR检测方法检测显示阳性率为33.0%,二者符合率为96.2%,表明该方法更适用于临床样品检测。本研究建立的IBRV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、快速高效,对于IBRV的检测和流行病学调查具有重要意义。

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gB和gD的研究进展

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),又称牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus 1,BHV-1),共编码30~40种结构蛋白,其中11种为囊膜糖蛋白。糖蛋白在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。糖蛋白gB对病毒侵入宿主细胞、在细胞间扩散及复制至关重要;糖蛋白gD在病毒复制、传播和感染机制方面作用重大,具有良好的免疫原性,是诱导产生中和抗体的主要糖蛋白。对gB、gD的研究不仅可从蛋白层面解析病毒侵染机制,还能够为牛传染性鼻气管炎的临床诊断和预防提供理论依据。本文针对牛传染性鼻气管炎病毒的主要糖蛋白gB、gD的研究结果进行综述,分析其生物学功能以及在疫苗和诊断方面的应用,以期为牛传染性鼻气管炎侵染机制和防控提供参考。

牛传染性鼻气管炎病毒免疫学检测方法研究进展

牛传染性鼻气管炎(传染性脓疱外阴阴道炎)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染引起的传染病,流行范围较广。该病在临床上主要有呼吸道和生殖道两种表现型,引发多种症状,给牛养殖业造成了巨大的经济损失。病毒侵入牛体后造成持续性感染,病牛长期或终生带毒,给防控带来极大困难,IBR的综合防控依赖于精准的检测方法。基于抗原-抗体特异性识别反应的免疫学检测方法在特异性、敏感性、样品前处理简便性、现场适用性、检测效率等方面优势突出。IBRV的gB蛋白、gC蛋白、gE蛋白、gG蛋白等常被作为靶抗原进行检测试剂盒的研发,从IBRV的基因组结构、结构蛋白特点、选用的IBRV毒株、靶抗原的表达方式、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法的建立、不同方法的符合率等方面综合论述了IBRV免疫学检测方法的研究进展,以期为该病原快速、精准、便捷的检测诊断试剂的研发提供参考。

牛传染性鼻气管炎病毒gC蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gC蛋白的特异性单克隆抗体,并分析其免疫学特性,以原核表达并纯化的重组gC蛋白为免疫原注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D6。3D6的亚类为IgG1型,轻链为κ链;上清、腹水抗体效价分别为6.4×103、1.28×105;Western blot和间接免疫荧光试验表明该单克隆抗体能识别牛gC蛋白。利用3D6细胞株分泌的单克隆抗体建立了检测IBRV的双抗体夹心ELISA方法,结果证明,该方法特异性和敏感性良好,为快速诊断IBRV和研究gC蛋白功能奠定了基础。

牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白的表达及gG-ELISA的建立

以牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）基因组DNA为模板,PCR扩增gG基因,克隆到T载体pMD18-T,经限制性酶切分析及序列测定鉴定正确后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体两种形式表达,重组蛋白质具有免疫学活性。包涵体蛋白经提纯、变性、复性后,作为包被抗原建立了gG-ELISA诊断方法。应用该方法与进口试剂盒（IDEXX）平行检测380份血清样品,两种方法的符合率为92%（351/380）。对6份病毒分离阳性血清的检测均为阳性,对非相关病原的阳性血清及中监所的阴性血清检测均为阴性,表明所建立的IBRVgG抗体的ELISA检测具有良好的灵敏度与特异性。对1248份奶牛血清样本进行了检测,进口牛群的IBRV抗体阳性率平均为21.7%,湖北本地中国黑白花奶牛的抗体阳性率在不同牧场之间变化很大,范围为0.0%-41.5%。

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测。结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测。

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的截短克隆与表达

以牛传染性鼻气管炎病毒BarthaNu/67株的DNA作为模板,用PCR扩增gE基因并克隆至pGEM-TEasy载体,再以此质粒作为模板将gE基因分成6个片段,分别插入原核表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行了表达。蛋白电泳结果表明6个片段中有2个片段以可溶形式表达,1个片段以包涵体形式表达,另外3个片段没有表达。采用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下对两个可溶性片段进行了纯化。经免疫印迹试验,间接ELISA和交叉试验证明,两个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应,而与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应,显示其具有良好的抗原性和特异性,可用于牛传染性鼻气管炎gE-ELISA诊断方法的建立。

牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛支原体(M.bovis)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BPIV3的HN基因、IBRV的g C基因、BVDV的5'UTR和M.bovis的oppD/F基因序列设计特异性引物,通过优化反应条件建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法。结果显示,该方法对牛呼吸道合胞体病毒、小反刍兽疫病毒、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型无特异性扩增,对BPIV3和BVDV的cDNA最低检测量分别为100 pg和1 ng,对IBRV和M.bovis的DNA最低检测量分别为10 pg和100 pg,具有较高的特异性和灵敏性。对临床33份鼻拭子样品和12份牛肺样品的检测结果与已发表文献中PCR方法的检测结果一致。本研究建立的多重PCR检测方法可同时对BPIV3、IBRV、BVDV和M.bovis进行检测,为这4种病原的诊断和检测提供了一种实用、便捷的方法。

牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立

利用套式PCR技术建立一种快速检测牛传染病鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)并能区分野毒株和gB基因缺失疫苗的方法。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gB和gE基因序列,应用pri mer5.0软件设计了gB/BN和gE/EN的2套套式PCR引物,分别对IBRV标准株进行PCR扩增,结果表明,这2套引物均能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带;用此引物对同属的伪狂犬病毒、马立克氏病毒、鸭瘟病毒进行扩增,具有良好的特异性。引物gB/BN和gE/EN的检测灵敏度分别为0.01TCID50和0.1TCID50。

抗猫传染性鼻气管炎病毒药物的体外筛选

试验旨在检测抗病毒药物对猫传染性鼻气管炎病毒的有效性。利用F81细胞建立抗猫传染性鼻气管炎病毒药物的体外筛选模型,采用MTT法检测,计算病毒的抑制率。结果显示,阿昔洛韦、利巴韦林、L-赖氨酸、板蓝根和黄芪多糖的半数有效浓度(IC50)分别为9.5、3.3、3.4、161.0和4.7μg/mL,聚肌胞IC_50为6.0mg/mL,治疗指数TI分别为76.8、39.3、2 588.0、4.5、78.7和5.8。结果表明,L-赖氨酸和黄芪多糖为高效抗猫传染性鼻气管炎病毒药物。

牛传染性鼻气管炎病毒LUX^(TM)新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^(TM)引物,建立LUX^(TM)新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应,而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性,检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明,LUX^(TM)荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0.04 TCID_(50),比病毒分离敏感性至少提高10倍;对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品,LUX^(TM)荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10~3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中,该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40 TCID_(50)、牛抗凝全血、血清和临床精液中0.04 TCID_(50)的病毒,说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUX^(TM)荧光PCR方法快速敏感,适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。

牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒三重二温式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性支气管炎病毒(IBRV)的三重二温式PCR检测方法。根据GenBank中MB、BVDV和IBRV的保守基因Uvrc基因、5′端非编码区(5′-UTR)和GB基因,分别设计了3对特异引物,将三温式PCR扩增程序简化为两个温度梯度,优化反应条件建立了用于同时检测MB、BVDV以及IBRV 3种常见牛呼吸道传染病病原的三重二温式PCR。结果显示,该方法特异性好,只对MB、BVDV和IBRV模板进行扩增,扩增的目的片段长度分别为412、170、727bp,对其他牛病原体无特异性扩增;灵敏度高,最低能同时检测到10 000拷贝的目的核酸;干扰性小,能同时检测3个不同浓度的模板。研究所建立的MB、BVDV和IBRV三重二温式PCR检测方法,具有特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,具有很高的临床应用价值。

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测

经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。