鸡传染性法氏囊病病毒VP5的原核表达、多抗制备及初步应用

传染性法氏囊病(infectious bursal disease virus,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明:试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。

非编码RNA在传染性法氏囊病病毒感染中的研究进展

传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBD virus, IBDV)引起的急性、高度传染性和免疫抑制性禽类疾病。近年来,随着新型变异毒株的出现,IBDV仍然威胁着全球家禽养殖业的健康发展,宿主和IBDV之间的“战役”似乎永不停息。因此,迫切需要制定一种更全面和更有效的策略来控制该疾病,而深入了解IBDV与宿主之间的相互作用,将有助于开发新型疫苗。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNAs)是一类丰富的不编码蛋白质的RNA分子,其中包括微小RNA(microRNAs, miRNAs)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)和环状RNA(circular RNA,circRNAs)。近年来,研究发现ncRNAs广泛参与IBDV与宿主的相互作用过程,在IBDV感染中发挥重要的调控作用。本文阐述了宿主miRNAs、lncRNAs和circRNAs在IBDV感染中的作用,以期为IBDV的感染与致病机制研究提供理论参考和新思路。

2株肉鸡源传染性法氏囊病病毒的分离鉴定

为了解传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的流行情况,监测其优势流行毒株的基因型变化,对疑似IBDV感染的临床病料进行检测,通过有限稀释法对IBDV毒株进行分离纯化,对分离毒株进行遗传进化分析和致病力分析。结果显示:从阳性病料中成功分离得到2株纯净的IBDV毒株;遗传进化分析结果显示,HN-2022-1株属于经典株,其VP2蛋白高变区具备经典毒株分子标志;AH-2022-1株属于HLJ0504样超强毒株,存在节段重配现象,其VP2蛋白高变区除具备超强毒株分子标志外,还具备经典株、早期变异株分子标志。此外,AH-2022-1株在VP2蛋白第一亲水区还发现了3处从未报道过的氨基酸突变,这导致第一亲水区的亲水性下降,可能引起该毒株发生毒力变化。致病力分析结果显示,2株IBDV均可引起严重的法氏囊萎缩,发病率100%,但仅AH-2022-1株可引起20%死亡率,与HLJ0504样株报道的60%~80%死亡率并不一致。提示:IBDV处于不断进化中,IBDV经典毒株仍在我国持续流行,研究结果为我国IBDV感染的防控提供了一定参考。

传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量RT-PCR检测方法的建立

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量RT-PCR结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规RT-PCR的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价

【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株(vaIBDV)VP2蛋白原核表达质粒,并明确VP2蛋白的免疫原性,为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。【方法】从IBDV新型变异株(BZ)中扩增VP2基因片段,亚克隆至pET-28a(+)载体上构建重组原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡,通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。【结果】在25℃下以IPTG进行诱导表达,获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表达,大小约40 kD,且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应,其琼扩效价可达1∶32;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好,安全性高,无免疫引起的不良反应,剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8,而血清抗体效价均在1∶20000以上,表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应,抗体阳性率达100%;使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况,结果显示免疫组鸡只均未发病,其法氏囊也无明显萎缩现象,即免疫保护率达100%。【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达,且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好,能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果,为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87在DF-1细胞和Vero细胞感染性研究

为比较传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗株B87对DF-1细胞和Vero细胞易感性,对比了IBDV B87株感染两种细胞后的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒基因组dsRNA、半数组织感染量(median tissue culture infective dose,TCID 50)水平、病毒载量及VP2基因表达水平。结果显示,IBDV B87株感染后,DF-1细胞CPE程度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒基因dsRNA荧光密度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒载量荧光密度高于Vero细胞,且DF-1细胞中病毒滴度(105.423±0.03296 TCID 50/0.1 mL)极显著高于Vero细胞中病毒滴度(102.592±0.03428 TCID 50/0.1 mL,P<0.01),VP2基因表达量显著高于Vero细胞(P<0.05)。说明IBDV B87株对DF-1细胞的感染性高于Vero细胞。

一株鸡传染性法氏囊病毒变异株的鉴定与致病性

近日,在福建省南平市某鸡场发现一株新的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)流行株,并将其命名为IBDV-FJ02.为了明晰IBDV-FJ02株遗传变异情况和临床致病特征,进行了A节段基因组序列和特征性氨基酸位点的分析、基于A节段和B节段的新型基因型分类以及对无特定病原体(SPF)鸡致病性的研究,旨在为鸡传染性法氏囊病的防治提供依据.结果显示:IBDV-FJ02株A节段核苷酸序列与早期变异株E的同源性最高,达95.6%,与中国变异株SHG558在同一分支上;IBDV-FJ02株VP2-4-3蛋白氨基酸序列第222位氨基酸为T,第249位为K,第318位为D,参考变异株中仅GLS、E与其一致,位点N^(213)、T^(222)、K^(249)、 D^(318)、E^(323)均符合变异株的特征.根据新型基因型分类方案,显示IBDV-FJ02株属于A2dB1基因型,即IBDV新型变异株类群.致病性测定结果显示:IBDV-FJ02株感染3周龄SPF鸡并不会导致感染鸡只死亡,在感染后21 d内,主要引起鸡只法氏囊的严重萎缩和脾脏的轻微肿大.上述结果表明,IBDV-FJ02株是一种IBDV新型变异株,具有明显的IBDV变异株致病特点.

基因自然重排鸡传染性法氏囊病病毒的分子特征

为了对某鸡群疑似传染性法氏囊病(IBD)的病例进行分子诊断、病毒分离和分子特征分析,本试验通过核酸检测调查该鸡群法氏囊组织和病毒分离物中传染性法氏囊病病毒(IBDV)的感染情况,将分离得到的毒株命名为GL1906,继而对该病毒基因组双节段的VP2高变区(vVP2)序列和VP1-b序列进行分析。结果显示,GL1906 vVP2基因的特征性氨基酸位点在222A、256I、284A、294I和299S上均符合超强毒株(vvIBDV)的特征,但279N符合致弱毒株的特征;VP1-b基因在242D、390L、393E与弱毒株一致,287A与vvIBDV一致,此外第777~782位核苷酸序列为GGTGCC,与弱毒株一致;GL1906 vVP2的核苷酸、氨基酸序列与vvIBDV的同源性最高,在系统进化树中与vvIBDV同为A3分支;GL1906 VP1-b的核苷酸、氨基酸序列与B节段属于独特来源的NN1172同源性最高,在系统进化树中同属于B3独特分支。结果表明,本试验分离株GL1906的基因组双节段vVP2和VP1-b具有不同的来源,是基因型为A3B3的基因自然重排毒株。

VP1甲基化修饰对传染性法氏囊病病毒的复制至关重要

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)属于禽双RNA病毒科双RNA病毒属,IBDV主要感染雏鸡,3日龄至8周龄鸡均可感染,以5周龄鸡最为易感。1997年我国首次在广州发现并分离到病毒,IBDV现已全球流行。有关其病毒学特征、致病性等方面的研究尚不全面,依然存在很多未知。VP1是该病毒的唯一RNA依赖的RNA聚合酶,负责病毒基因组复制与转录,也是抗病毒药物研发最佳设计靶点。病毒蛋白翻译后修饰在调节病毒复制中发挥重要作用,修饰位点是非常重要的抗病毒药物研发靶点,有关IBDV VP1翻译后修饰研究较少,2009年报道VP1可以发生盐酸胍修饰。

VP1磷酸化修饰对传染性法氏囊病病毒复制至关重要

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)为双RNA病毒属、禽双RNA病毒科成员,IBDV主要感染5周龄左右的雏鸡,常伴随细菌继发感染,迅速增加死亡率。自上世纪50年代发现并分离到IBDV以来,对其研究持续了近70年。有关其病毒学特征、致病性等方面的研究尚不全面,依然存在很多未知。VP1是该病毒RNA依赖的RNA聚合酶,负责病毒基因组复制与转录。病毒蛋白翻译后修饰在调节病毒复制中发挥重要作用,有关IBDV VP1翻译后修饰研究较少,2009年报道VP1可以发生盐酸胍修饰,但对其聚合酶活性无影响。2019年研究报道VP1泛素化、SUMO1化修饰,均有助于VP1聚合酶活性和IBDV复制。有关VP1磷酸化修饰未见文献报道,因此研究IBDV VP1磷酸化修饰的分子机制及其生物学意义,为深入解析VP1功能提供理论依据,同时为寻找IBDV致弱位点提供线索。

传染性法氏囊病病毒新型变异株的分离和鉴定

为调查我国部分地区规模化养鸡场传染性法氏囊病病毒(IBDV)新型变异株流行现状,参考IBDV VP2蛋白高变区序列设计Taqman-MGB探针和引物,建立IBDV快速检测方法,利用其检测来自河北邯郸、江西宜春、重庆7家大型育雏场送检法氏囊病料,并对阳性病料进行病毒分离、测序和进化分析。成功建立了一种兼顾IBDV鉴定和测序分型的荧光定量PCR方法,该方法在10^(1)~10^(8)拷贝/μL范围内具有良好线性关系(相关系数为0.9963),扩增效率良好(扩增效率为109%),对其他常见病毒无扩增,最低检测限为1.25×10^(1)拷贝/μL;利用该方法检测邯郸地区4家育雏场送检样品均为阳性,测序均为IBDV新型变异株,采用鸡胚自阳性样品中分离到3株IBDV(T2021与T2022、J2021);对分离株A节段测序发现,3株IBDV分离株均属国内新型变异株,与国内新型变异株SHG19氨基酸同源性为100%,核苷酸同源性为98.0%~98.6%,T2021与T2022、J2021分属两个进化分支。建立了一种IBDV快速检测方法,发现IBDV国内新型变异株在我国部分地区仍存在。

应用原位PCR对鸡传染性法氏囊病病毒早期侵染过程的研究

人工接种 35日龄SPF鸡传染性法氏囊病病毒 ,间隔不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、盲肠扁桃体、肾、肝和腿肌进行了原位PCR检测 ,同时观察各组织病理变化。结果无论是H毒株还是Ts毒株 ,接种后 4h肝、肾、脾等组织中即出现明显的阳性信号 ,Ts毒株 4hPI从胸腺、盲肠扁桃体、腿肌等组织中也检出了病毒基因序列。接种H毒株和Ts毒株后 2 8h和 40h ,法氏囊淋巴细胞开始出现变性、坏死。在阳性信号检出的时间上 ,法氏囊较肝、肾、脾等组织是滞后的。H毒株较Ts毒株在早期对法氏囊具有更强的侵染能力。

鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因是新近被确定的非哺乳类IL 2基因。将鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2 VP4 VP3 )分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P <0 0 5 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应 (P <0 0 5 )。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)ZJ2 0 0 0株的多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)基因插入 pCI质粒的CMV启动子下游 ,构建了真核表达质粒pCI VP2 /VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物 (ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗 ,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明 :以肌内和皮内联合免疫法效果最好 ,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应 ;大于 2 0 0 μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力 ;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比 ,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低 ,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实 ,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应 ,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性

鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株GX8/ 99,系 1999年从广西一自然发病鸡群采集到。用原始病鸡法氏囊悬液连续 3次人工感染SPF鸡后 ,再取其法氏囊制备悬液 ,分装 ,在 - 70℃保存。以此悬液经卵黄囊接种 10日龄SPF鸡胚 ,测定鸡胚的半数致死量 (ELD50 )。随着鸡的日龄和接种剂量的不同 ,其致死率有很大差异。对 2 8～ 30日龄SPF鸡 ,病毒接种量为 2 0 0个ELD50 时 ,感染后 7日内死亡率最高可达 73%～ 90 5 % (11/ 15和 19/ 2 1) ;感染量为 2 0个ELD50 时 ,死亡率亦可达 5 3%～ 92 % (8/ 15和 2 3/ 2 5 )。以 5 0 0个ELD50 感染 2 8～ 10 4日龄的SPF鸡 ,死亡率均在 5 5 1%～ 6 7 2 % ;甚至 113～ 12 0日龄的SPF鸡 ,感染后仍有 10 %～ 15 %致死率。但 12 8日龄的SPF鸡感染后既不引起死亡也不表现任何症状 ,但抗体全部转阳。人工接种发病死亡的鸡 ,其法氏囊的出血程度也随感染量和年龄而异。 5 0日龄鸡接种 2 0 0 0个ELD50 后 ,死亡的鸡 10 0 % (12 / 12 )法氏囊严重出血 ;而 4 0日龄鸡感染 2 0 0个ELD50 后 ,死亡鸡中仅 17% (3/ 18)发生出血。在 2、3、4周龄带有母源抗体的商品代蛋鸡 ,以 2 0 0 0个ELD50 病毒接种后 ,只引起 10 % (2 / 2 0 )、35 % (7/ 2 0 )和 35 % (7/ 2 0 )的死亡率。但在

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要危害3～6周龄的雏鸡。该病于1957年首次发现于美国Gumboro地区。50年来，IBD一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（vvIBDV）的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（OIE）已将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。

传染性法氏囊病病毒YL051、YL052的分离及其VP2基因高变区序列的比较分析

应用鸡胚绒毛尿囊膜接种的方法，从一个疑患传染性法氏囊病的鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）（分别命名为YL051和YL052）；利用反转录-聚合酶链式反应技术扩增分离株VP2基因的高变区序列，并采用限制性内切酶分析技术和核苷酸序列测定技术，对分离株进行致病型鉴定及其基因差异的分析。结果表明：分离株YL051属IBDV的超强毒株（vvIBDV），而YL052株既具有强毒株的特征即七肽区（SWSASGS）和279D，但同时也具有284T的弱毒株特征，可能属于介于强毒株与弱毒株之间的一个中间型。与国内外参考毒株的序列比较分析发现：YL051与其他vvIBDV的核苷酸同源性达94％～97％；YL052则与经典毒株STC、疫苗株B87的核苷酸同源性均为94．3％。

中药粗提物对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染细胞能力的影响

将黄芪、连翘等八味中药的粗提物与鸡传染性法氏囊病病毒以三种顺序 (先加中药后加病毒、先加病毒后加中药、中药和病毒同时加入 )加入至培养 2 4 h、已长成完整单层的鸡胚成纤维细胞 (CEF)上 ,观察其对病毒感染细胞能力的影响。结果表明 ,在细胞安全浓度范围内 ,仅黄芪粗提物在先于病毒或与病毒同时加入时抑制 IB-DV病毒感染 。

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为载体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性.重组ZJ111/pCI-IL-2菌能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P<0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P<0.05).上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.