全细胞膜片钳技术在神经元钙通道药理研究中的应用

全细胞膜片钳技术是研究离子通道和药物对离子通道影响的最重要的技术之一,但是由于其对实验技术要求高,对实验标本制备和实验环境、实验用溶液等条件均有严格要求等原因致使其在实际运用中较为困难。本文报告了运用全细胞膜片钳技术进行神经元钙通道药理研究的一些经验。

全细胞膜片钳技术检测化学损伤致痫大鼠海马脑片电生理特性

目的应用全细胞膜片钳技术检测化学损伤致痫大鼠海马脑片神经元基本电生理特性。方法将成年SD大鼠建立氯化锂-匹罗卡品模型后,急性分离获得海马脑片,应用全细胞膜片钳电流钳技术实时观察化学损伤致痫大鼠海马脑片CA1区锥体神经元膜电位及其单位时间内动作电位频率的变化情况;通过全细胞膜片钳电压钳技术,检测化学损伤后大鼠海马脑片CA1区锥体神经元的诱发兴奋性突触后电流的变化情况。结果急性分离所得海马脑片CA1区锥体神经元的胞体饱满并可见突起。可在大鼠海马脑片CA1区锥体神经元记录到自发的动作电位及刺激诱发兴奋性突触后电流,且化学损伤后神经元膜电位绝对值降低,动作电位频率加快,诱发的兴奋性突触后电流幅值升高。结论全细胞膜片钳技术可以用于癫痫大鼠急性分离所得海马脑片的电生理研究,化学损伤后神经元兴奋性明显升高,为开展癫痫相关的功能研究提供了新的途径。

应用穿孔全细胞膜片钳记录技术研究培养大鼠耳蜗螺旋神经节神经元的基本电生理特性

为了深入了解耳蜗螺旋神经节(SG)神经元的基本电生理特点,本研究首先成功培养了急性分离的大鼠SG神经元,然后采用穿孔全细胞膜片钳记录技术观察了培养SG神经元的基本电生理特性。结果表明,可从培养的SG神经元记录到动作电位,且不同的SG神经元具有异质性的放电特征。上述结果提示穿孔全细胞膜片钳记录技术可用于体外培养耳蜗SG神经元的电生理特征研究,为开展听觉信息传导和调控的功能研究开辟了新途径。

生理药动学模型结合全细胞膜片钳技术评价胺碘酮和去乙基胺碘酮的体外心脏安全性

目的通过生理药动学(PBPK)模型结合全细胞膜片钳技术研究胺碘酮及其活性代谢产物去乙基胺碘酮对心肌细胞hERG通道和动作电位的影响,评价其体外心脏安全性。方法基于复合PBPK模型预测胺碘酮、去乙基胺碘酮在人体心肌药动学曲线。选用模型预测的胺碘酮、去乙基胺碘酮浓度(预测胺碘酮血浆浓度0.76 mg/L,心肌浓度17 mg/L)、(预测去乙基胺碘酮血浆浓度0.13 mg/L,心肌浓度8.5、17 mg/L)分别灌流HEK293细胞(hERG)、人干细胞诱导分化心肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录并观察药物对外向钾流、心肌细胞动作电位的影响。结果PBPK模型预测胺碘酮心肌浓度约为血浆浓度的23倍,而去乙基胺碘酮心肌浓度是血浆的约130倍。静脉滴注或口服多次给药后胺碘酮的血浆、心肌浓度均基本保持恒定,而去乙基胺碘酮的血浆、心肌浓度均呈持续升高,消除缓慢,易蓄积。胺碘酮和去乙基胺碘酮均对hERG通道有较强的抑制作用,并呈浓度依赖性;胺碘酮在血浆浓度、心肌浓度下,对hERG通道的抑制率分别为78.9%和95.8%,去乙基胺碘酮在血浆浓度、心肌浓度下(0.13、8.5、17 mg/L)对hERG通道的抑制率分别为28.3%、87.4%和96.7%。胺碘酮、去乙基胺碘酮在血浆浓度下对心肌细胞动作电位的影响不显著,但在心肌浓度下对动作电位幅度、动作电位时程、静息电位均有较强的抑制作用,并使动作电位发放频率加快,且呈现浓度依赖性。结论临床常用剂量下,分布在心肌的胺碘酮、去乙基胺碘酮对钾离子流、心肌动作电位均有明显的抑制作用。这种抑制作用可能对心律失常的心肌在一定程度上有益,但可能具有一定的安全性风险,特别是去乙基胺碘酮在心肌组织的蓄积效应。

全细胞膜片钳技术在视网膜神经元电压门控离子通道研究中的应用

了解视网膜各种神经元神经电信号特点、产生机制及影响因素 ,对从功能角度评价视网膜神经细胞培养状态和移植效果具有重要意义。本文介绍一种先进的电生理学研究方法———全细胞膜片钳法在视网膜神经生理学中的应用 ,以及通过该方法对视网膜神经节细胞、双极细胞。

一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的:探讨一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜所造成的封接不稳定。方法:以人肠系膜动脉平滑肌细胞为研究对象,采用穿孔全细胞膜片钳技术,记录人肠系膜动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道(big-conductance Ca2+-activated potassium channels,BKCa)宏观电流以及自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)。结果:采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到人肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa和STOCs。结论:穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究提供实验基础。

全细胞膜片钳技术在遗传性长QT综合征和不明原因猝死中的研究进展

基因突变导致的心脏离子通道疾病被认为是引起不明原因猝死的首要死因,长QT综合征作为最常见的心脏离子通道疾病之一,其致病基因突变在各类SUD中被不断报道。利用全细胞膜片钳技术进行心脏离子通道功能验证对于评估基因突变的致病性、明确SUD死者的死亡原因、筛查SUD危险人群具有重要的法医学意义。对全细胞膜片钳技术的基本原理及其在长QT综合征的发病机制与不明原因猝死研究中的应用进行综述。

一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的:探讨一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法。此方法使玻璃电极与细胞内液保持电化学连续性,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜造成的破膜难和封接不稳,以及常规全细胞膜片钳破膜后造成的封接不稳。方法:以成骨细胞为研究对象,采用β-七叶素穿孔全细胞膜片钳技术,记录骨细胞L型钙通道电流。结果:采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到成骨细胞上L型钙通道电流。结论:穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究疾病中成骨细胞的病理生理机制提供实验基础。

全细胞膜片钳研究离体小鼠内侧膝状体亚核神经元电生理特性

内侧膝状体(medial geniculate body,MGB)是听觉通路在丘脑的重要中继站,为了探究小鼠MGB亚核神经元的电生理特性,使用离体全细胞膜片钳技术记录到99个MGB神经元,其中腹侧核(ventral division of MGB,MGBv)神经元36个,背侧核(dorsal division of MGB,MGBd)神经元34个,内侧核(medial division of MGB,MGBm)神经元29个。结果表明,神经元对去极化电流的反应具有爆发型(bursting)(16.2%,16/99)和紧张型(tonic)(83.8%,83/99)两种发放模式,并且所有MGB神经元在超极化电流刺激结束后均有去极化反弹(rebound),而仅有少数神经元(17.2%,17/99)在超极化刺激过程中有超极化激活的内向电流(hyperpolarization-activated inward current,I_h)。此外,MGB各亚核神经元的静息膜电位(resting membrane potential,RMP)和激活阈值(active threshold)存在显著性差异(P<0.05)。以上表明MGB各亚核的电生理特性存在差异,该结果有助于理解MGB各亚核在听觉信息处理中产生不同功能的原因。

快反应电压敏感染料脑片功能性成像结合全细胞膜片钳记录的体外研究

在大脑的许多区域，局部回路的连接被分离成特定的层状体或神经纤维球，如海马、大脑新皮质和嗅球等。在解剖学上这些区域相互分隔。而功能成像对表现回路特征发挥着独特的作用。电压敏感染料成像（voltage-sensitive dye imaging）是通过探测相应脑组织的电活动或局部新陈代谢活动所引起的光学性质的微小变化来进行功能成像的。

Amphotericin B在全细胞穿孔膜片钳技术中的应用研究

目的:为研究海德氏突触的电生理特性,建立用amphotericin B穿孔的膜片钳技术。方法:本文应用两性霉素B(amphotericin B)在小鼠脑干的calyx细胞上进行穿孔膜片钳技术的研究。结果:应用amphotericin B进行穿孔后,通道电流衰减现象显著变慢。Amphotericin B的最适浓度为400μg/ml。结论:本研究摸索出了一种稳定的穿孔膜片钳全细胞记录技术,可以更有效,更真实的反应神经元通道电流的电生理特性。为穿孔膜片钳技术在听觉信息传导和调控研究中的应用提供了基础资料。

利用膜片钳技术对小鼠嗅感觉神经细胞电生理学的初步研究

目的利用全细胞膜片钳技术初步探讨小鼠嗅感觉神经细胞的电生理学特性。方法取生后7～14d的昆明小鼠的嗅黏膜，用胰蛋白酶消化组织，获取单个嗅感觉神经细胞，并用全细胞膜片钳技术对急性分离的嗅感觉神经细胞的离子通道进行记录和分析。结果急性分离的小鼠嗅感觉神经细胞的功能状态良好，在膜片钳记录过程中细胞与记录电极之间能形成高阻封接，并可记录到电压门控性的内外向电流。内向电流具有快速激活和失活的特性，并可被0．1μmol／L河豚毒（TTX）完全阻断，说明内向电流主要由Na^＋介导；外向电流包含有瞬时成分和持续成分，并可被CsCl完全阻断，说明外向电流主要由K^＋介导。结论急性酶分离的小鼠嗅感觉神经细胞的电生理学特性的初步研究，为嗅觉传导机制和药理学的研究提供依据和指导。

穿孔膜片钳记录猪冠状动脉平滑肌细胞K^+电流技术初探

常规全细胞膜片钳模式形成的同时,细胞内液与电极液交换造成细胞内物质丢失,此现象对小细胞的影响更为明显。穿孔膜片钳技术使电极与细胞胞质之间保持电学连续性,它使细胞内环境保持稳定,利于研究胞内信息传导机制,并可改善常规全细胞膜片钳时破膜所造成的封接稳定性的破坏,有望提高实验的成功率。本研究报道应用此技术在猪冠状动脉平滑肌细胞上记录的全细胞K+电流和由大电导钙激活钾通道BKCa所介导的自发瞬时外向电流ISTOCs。

应用膜片钳技术探讨阿霉素对骨肉瘤(OS-732)及其耐药细胞(R-OS-732)钙离子通道的影响

目的：应用全细胞膜片钳技术测定ＯＳ－７３２及Ｒ－ＯＳ—７３２两种细胞的反应钙离子通道的钙离子电流，同时测定阿霉素单独及与异博定共同作用对两种细胞钙离子电流的影响。结果；ＯＳ－７３２细胞的峰值电流为（－０．２３０６±０．０１）ｎＡ（ｎ＝１０），Ｒ－ＯＳ－７３２为（－０．３０１４９±０．０４）ｎＡ（ｎ＝１０），二者相比差异显著（Ｐ＜０．０５）。阿霉素单独作用，随阿霉素浓度的增大（１～１００μｇ／ｍｌ），ＯＳ－７３２细胞峰值电流由（－０．２０６６９±０．０９）ｎＡ降到（－０．１０７０３±０．０６）ｎＡ，降低幅度为４５．１７％。Ｒ－ＯＳ－７３２细胞的峰值电流由（－０．２８４３５± ０．０４）ｎＡ降至（－０．２３８７３±０．０３）ｎＡ，降低幅度为７９．１８％。异搏定单独作用，当异搏定浓度为ｌμｇ／ｍｌ时，ＯＳ－７３２细胞的峰值电流降低幅度为５７．４％；Ｒ－ＯＳ－７３２细胞的降低幅度为５０．８１％。当阿霉素浓度为１０μｇ／ｍｌ，加入浓度为１μｇ／ｍｌ的异博定时。对于ＯＳ－７３２细胞降低幅度为７３．４４％，而Ｒ－ＯＳ－７３２细胞则为９１．３２％。

穿孔膜片钳技术在离子通道电流研究中的应用

目的:传统的全细胞膜片钳技术在离子通道电流的记录中存在机械稳定性差,对细胞的损伤大,以及胞内液的被渗析影响与细胞内信号转导和离子通道调控有关的第二信使物质的正常运行。而穿孔全细胞膜片钳技术应用二性霉素B或制霉菌素在细胞膜上形成特定的孔道,选择性地允许一些离子和大分子物质,从而使细胞内环境保持相对稳定,在一定程度上弥补了上述缺陷,实验成功率也相应提高。本文就穿孔膜片钳技术在全细胞离子通道电流记录中的应用进行探讨。

红景天苷体外灌流对大鼠心肌细胞膜钠通道电流的影响

目的观察红景天苷体外灌流对SD大鼠心肌细胞膜钠通道电流(INa)的影响。方法 SD大鼠颈部脱臼处死后,开胸剪断主动脉并取下心脏,采用Langendorff逆行主动脉灌流法急性分离SD大鼠单个心室肌细胞,置于培养皿,以电极外液灌流冲洗。置入微电极,充灌电极内液,采用全细胞模式的膜片钳技术检测INa,电流稳定后灌注红景天苷100μmol/L,再次检测INa。绘制电流-电压关系(I-V)曲线、稳态激活曲线及稳态失活曲线,观察灌流前后大鼠心肌细胞INa及相关曲线的变化。结果红景天苷灌流后INa幅值增加。红景天苷灌流后INa I-V曲线下移,但不改变I-V曲线形状、最大激活电位和反转电位。红景天苷灌流前后INa密度最大峰值分别为(-29.71±4.37)、(-58.66±8.21)p A/p F,灌流前后相比,P<0.05。红景天苷灌流前后INa稳态失活曲线的半数失活电压分别为(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)m V,半数失活电压向正值方向移动,斜率因子分别为-10.23±1.30、-7.71±1.12,灌流前后半数失活电压相比,P<0.05。红景天苷灌流前后INa稳态激活曲线半数激活电压差异无统计学意义。结论红景天苷体外灌流可使SD大鼠心肌细胞膜INa的I-V曲线下移,增加电流幅值,该作用可能与红景天苷增加钠通道失活电位、抑制电流失活有关。

人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性的研究

目的 研究人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性。方法 采用原代培养的非小细胞肺癌细胞、肺部良性病变和癌旁支气管上皮细胞 ,应用膜片钳全细胞记录方式检测细胞膜钾离子通道特性。结果 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜K+ 通道表达的K+ 电流具有电压依赖性 ,能被K+ 通道阻断剂TEA阻断。鳞癌细胞膜电流具有失活趋势和内向整流特点 ;腺癌细胞膜电流具有不失活特性 ,无内向整流特点。TP =5 0～ 90mV时 ,时间常数 (τ值 )为 3.6～ 9.8ms。非小细胞肺癌细胞膜电容为 ( 15 .35± 0 .65 )pF ,K+ 电流密度为 ( 12 1.0 8±8.35 )A/F。 ( 2 )非小细胞肺癌细胞膜K+ 电流幅度、电流密度和膜电容较支气管上皮细胞明显增高 (P <0 .0 0 1) ,癌细胞τ值显著小于支气管上皮细胞的τ值 (P <0 .0 0 1)。结论 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜存在与延迟整流性类似的钾离子通道 ,且表达明显增加 ,活动明显增强。 ( 2 )检测肺癌细胞膜K+ 通道可为研究肺癌发生、发展。

膜片钳技术在慢性痛大鼠背根神经节神经元电生理学特性改变中的应用

目的:以骨癌痛大鼠为例,探讨全细胞膜片钳技术在慢性痛研究中的应用。方法:急性分离背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元,利用全细胞膜片钳技术分别记录对照组和骨癌痛组大鼠小直径DRG神经元的动作电位及TRPV1(transient receptor potential vanilloid channel subfamily V member 1)的电流,分析大鼠小直径DRG神经元电活动的变化。结果:利用全细胞膜片钳技术可以记录到骨癌痛大鼠的小直径DRG神经元静息膜电位绝对值降低、动作电位发放频率增加、爆发动作电位的阈值降低、TRPV1通道的电流幅度增大。结论:全细胞膜片钳技术可以有效而直观的记录到单个神经元动作电位和电流的变化,并由此对神经元电生理学特性进行分析,从而进行慢性痛发病机制的研究。

降钙素基因相关肽对大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾离子通道的影响

目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)与大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道(KATP)之间的关系及其信号转导通路。方法酶解法急性分离SD大鼠心室肌细胞,采用Langendroff灌流装置,分别用含0.1nmol/L CGRP、1nmol/LCGRP8-37(CGRP特异性阻滞剂)、1μmol/L H-89(蛋白激酶A阻滞剂)的细胞外液灌流心室肌细胞,每个细胞采用给药前后自身对照,标准的全细胞膜片钳技术记录KATP电流,待细胞电流稳定后,观察不同药物对KATP电流的影响。结果 0.1nmol/L CGRP对KATP电流有明显的激活作用,电流密度-电压(I-V)曲线明显上移(P<0.05)。1nmol/L CGRP8-37和1μmol/L H-89可使CGRP激活的KATP电流明显降低,I-V曲线明显下移(P<0.05)。结论心肌细胞上CGRP与其特异性受体结合,通过蛋白激酶A激活KATP,增强KATP电流。

应用膜片钳技术研究豆腐果苷对hERG钾通道电生理功能的影响

目的:探讨豆腐果苷对hERG钾离子电流的影响及潜在心脏毒性。方法:使用稳定转染hERG基因的CHO细胞,通过全细胞膜片钳技术检测不同浓度豆腐果苷对hERG通道电流活动的作用。结果:豆腐果苷对hERG钾通道的IC50约为47μmol/L,比临床常规剂量下人体内峰浓度高1 000倍以上。结论:临床常用剂量下,豆腐果苷发生与hERG通道抑制作用相关的心脏安全性问题的可能性非常小。