育肥猪伪狂犬病病毒、蓝耳病病毒和胸膜肺炎放线杆菌混合感染案例分析

【目的】为猪场防治猪伪狂犬病提供经验借鉴,提升猪场疫病防控水平,提高养殖经济效益。【方法】介绍一起猪伪狂犬病病毒(PRV)变异毒株引起17~18周龄生长育肥猪陆续出现严重呼吸道疾病(死亡率高达10%)的案例,通过病猪解剖、胸膜肺炎放线杆菌(APP)分离和常规抗生素药敏试验,以及蓝耳病病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒的病原荧光定量PCR(qPCR)检测,对疫情进行综合诊断。【结果】病料中分离到猪胸膜肺炎放线杆菌,荧光定量PCR检测PRRSV和PRV病原均为阳性,确诊为感染猪伪狂犬病病毒后,继发蓝耳病病毒、胸膜肺炎放线杆菌感染。采取伪狂犬病疫苗免疫+药物保健等措施后,疫情得到控制。【结论】猪场一定要对猪伪狂犬病引起足够的重视,日常生产中需要做好猪伪狂犬病的防控,尤其要执行科学的免疫程序。面对伪狂犬病病毒和其他病原的混合感染,要分清楚哪个是原发病原,哪些是继发感染,从而采取针对性的治疗措施,从根源上控制疫情。

伪狂犬病病毒GD1406变异株的抗原性分析

为了解近年来广东省伪狂犬病病毒(PRV)变异情况,本研究从猪场收集Bartha-K61活疫苗免疫后的猪血清559份,经ELISA筛选出326份gB抗体阳性且gE抗体阴性的猪血清,进行中和试验,分析血清中的疫苗抗体对Bartha-K61株和临床分离到的PRV GD1406野毒株的中和能力。进一步应用小鼠进行交叉免疫保护性试验。结果显示,187份gB阳性且gE阴性的猪血清样品对Bartha-K61株和PRV GD1406野毒株的平均中和抗体滴度分别为1:57和1:13,并且免疫Bartha-K61株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率仅为20%,而免疫PRV GD1406野毒株使小鼠免受Bartha-K61株致死性攻击的保护率为100%,免疫灭活PRV GD1406野毒株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率为40%。根据试验结果推测,PRV GD1406野毒株与Batha-K61株之间存在抗原差异性,现用疫苗不能有效抵抗PRV变异株攻击。本研究结果将为PRV的防控提供实验依据,为研制PRV新疫苗提供新的思路。

伪狂犬病病毒变异株Fujian-LY对生长育肥猪的致病性研究

将6头80日龄伪狂犬病病毒(PRV) g B、g E抗体均为阴性的生长育肥猪随机分成对照组和感染组,每组3头。感染组试验猪通过颈部肌肉接种Fujian-LY株2m L,对照组猪经相同途径接种等体积的DMEM,每日观察记录试验猪的发病及死亡情况,试验期为7 d。结果显示,感染组育肥猪临床症状表现明显,在感染1 d后体温均开始升高,随着病情的发展,表现咳嗽、喘气、流鼻涕等典型的呼吸道症状,至试验结束未出现死亡。病理剖检显示,与对照组相比,感染育肥猪除脑部病变明显外,心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织均未出现明显的肉眼可见病变。组织病理学检查结果显示,PRV Fujian-LY株已对感染育肥猪的多个主要器官组织造成了较为严重的病理损伤:脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围的"血管套"现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;免疫器官中淋巴细胞减少等。同时采用PCR及免疫组织化学方法对这些组织进行检测均呈PRV阳性。g B、g E抗体检测结果显示,感染猪在感染后第7天PRV g B、g E抗体均开始转阳。上述结果表明,PRV Fujian-LY株对生长育肥猪具有较强的致病性,在发病猪体内分布广泛。

猪伪狂犬病毒变异株HN1201 gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得用于伪狂犬病毒(PRV)临床检测和实验室研究所需的PRV gB特异性抗体,以PRV变异病毒株PRV HN1201免疫小鼠,取免疫后小鼠脾脏细胞与SP/20细胞融合,制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选出1株稳定分泌PRV gB蛋白抗体的单克隆细胞系,经鉴定该细胞系所分泌抗体为IgG1亚型,腹水纯化抗体的IFA效价为2^-11;细胞培养上清和腹水纯化抗体用于Western blot的最佳稀释比分别为1∶50和1∶5000;杂交瘤细胞诱导小鼠腹水的中和效价为1∶25。IPMA、IFA及Western blot试验结果显示,制备的单克隆抗体能特异性识别PRV gB蛋白。

应用Cre/loxp系统构建含有BAC序列的重组伪狂犬病毒

近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。

共表达PCV2 Cap蛋白和IL-2重组变异株伪狂犬病病毒构建及对小鼠的免疫原性

为获得有效预防猪圆环病毒2型(PCV2)及伪狂犬病(PR)感染的重组活载体疫苗,利用同源重组将PCV2 YY株ORF2和细胞因子佐剂IL-2基因插入rPRV-gE^(-)/TK^(-)/EGFP^(+)缺失的TK基因位点,获得重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)。将重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)及对照rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)、PCV亚单位疫苗、PR活疫苗和DMEM培养液分别免疫小鼠,4周后加强免疫1次,利用PCV2间接ELISA试验、PRV血清中和试验、T淋巴细胞转化试验和细胞亚群及因子测定等评价重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)的免疫原性。结果显示,构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)可在BHK-21细胞内表达,免疫鼠产生抗PCV2和PRV的特异性中和抗体,能刺激CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞的增殖及促使IFN-γ、IL-4和IL-12细胞因子的表达水平明显升高。结果表明,成功构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)能有效诱导机体产生较高水平的免疫效果,IL-2起到免疫增强作用,可作为预防猪PR和PCV感染相关疾病的候选疫苗株。