检测猪伪狂犬病病毒gE抗体红细胞凝集试验的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)—猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病毒gE抗体的红细胞凝集试验。利用方阵滴定试验筛选出最佳抗原工作浓度为55μg/mL,血清最佳稀释度为1∶20,作用时间15 min,与猪瘟(CSF)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪乙型脑炎(JE)、猪布氏杆菌病(Brucellosis)阳性血清和PRV gE缺失疫苗接种的猪免疫血清均不出现红细胞凝集现象,与PRV标准阳性血清反应出现肉眼可见的凝集圈。与美国进口的PRV抗体检测gE-ELISA诊断试剂盒检测结果比较,50份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100%。红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。

猪伪狂犬病病毒gE抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)-猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为诊断抗原和胶体金标记物,以羊抗猪IgG包被硝酸纤维膜作为质控带,制作检测猪伪狂犬病毒gE抗体的双抗原胶体金试纸条。利用方阵滴定试验筛选出金标抗原最佳工作浓度为17.6μg,检测线诊断抗原最佳标记量为1.76μg,血清最佳稀释度为1∶10,作用时间15 min,与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪布鲁菌(Brucella)阳性血清和PRVgE缺失疫苗接种的猪免疫血清检测线均不出现红色条带,与PRV标准阳性血清反应检测线出现红色条带。试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果;试纸条在室温保存6个月,其特异性和敏感性没有明显变化;与美国IDEXX和法国LSI gE-ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果比较,1 164份猪血清的符合率均为90.55%。制备的胶体金试纸条具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。

三种伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的比较

为比较3种品牌(A、B、C)伪狂犬病病毒(PRV)g E抗体ELISA检测试剂盒的临床使用效果,应用中和试验来标定伪狂犬病非免疫猪场的180份临床血清样品,同时用3种试剂盒进行检测,并对试剂盒的重复性、敏感性、特异性以及与中和试验结果的符合度等指标进行测定与分析。结果显示:3种试剂盒的批内稳定性均较好,变异系数均小于10%;批间重复性差异较大,变异系数最小者为8.09%,最大者高达21.31%;3种试剂盒的诊断特性良好,敏感性为95.56%~97.78%,特异性为94.44%~100%;各试剂盒检测结果与中和试验结果均完全相符(Kappa值为0.91~0.96)。比较结果表明,3种试剂盒均适用于临床样品的PRV g E抗体检测,其中稳定性及敏感性俱佳的试剂盒C更适用于PRV的持续监测、早期发现、引种检疫及净化效果评估,而特异性与准确性最高的试剂盒B更适用于贵重病畜的诊断淘汰。因此,生产实践中应根据诊断目的合理选择最适试剂盒。

2016-2019年临沧市猪伪狂犬病病毒gE抗体流行病学调查

为了解近4年临沧市猪伪狂犬病病毒感染情况,从临沧市8个县(区)采集了6672份猪血清样品,用PRV gE-ELISA抗体检测方法进行PRV gE抗体检测。结果:2016—2019年临沧市规模猪场PRV gE抗体总阳性率分别为0、0、2.22%、0,其中只有2018年双江县和镇康县检测出PRV gE抗体阳性,阳性率分别为5.00%、1.00%;2016—2019年临沧市散养户猪场8个县(区)PRV gE抗体总阳性率在0~6.86%,其中凤庆县PRV gE抗体阳性率最高为6.86%,而云县和双江县PRV gE抗体均为阴性;2016—2019年临沧市散养户猪场各年度PRV gE抗体总阳性率为0.58%~2.87%,其中以2018年PRV gE抗体阳性率最高。说明临沧市部分县(区)存在猪伪狂犬病病毒的感染。

贵州省规模猪场商品猪群伪狂犬病病毒gB和gE抗体监测分析

为了解贵州省规模猪场伪狂犬病病毒的免疫抗体水平和感染情况,2022—2023年采集贵州省9个市(州)19个县的22个规模猪场商品猪(60~120日龄)血清样品732份,采用ELISA方法检测猪伪狂犬病病毒gB和gE抗体。结果:gB抗体合格数362份,合格率49.45%(362/732),整体免疫抗体合格率低于国家规定标准,仅有5个猪场(占比22.73%)的免疫抗体合格率达到国家规定标准;检出2个市(州)的5个猪场gE抗体阳性8份,阳性率1.09%(8/732),存在病毒感染。结论:监测的商品猪群伪狂犬病病毒gB抗体平均水平较低,整体合格率未达到国家规定标准要求,且少数猪场存在伪狂犬病病毒感染,应加强净化。

基于gE蛋白的羊伪狂犬病病毒间接ELISA的建立与应用

为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为42 ku,以包涵体形式表达;Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白作为包被抗原的最佳工作浓度为1μg/mL,待检血清100倍稀释,以HRP标记的兔抗山羊IgG 10000倍稀释作为二抗;检测临床样本时判定阴阳性的临界值为0.284;灵敏性试验结果显示,羊PRV阳性血清稀释2048倍时检测结果仍为阳性;批内变异系数(2.45%~5.00%)与批间变异系数(2.55%~7.41%)均小于10%;采用建立的方法检测其他常见羊源病毒阳性血清结果均为阴性;对收集的376份临床羊血清进行检测,PRV阳性率为10.6%。建立的间接ELISA检测方法可用于羊源样本中伪狂犬病病毒抗体的检测,该方法的建立为羊场PRV抗体检测提供了技术支持。

伪狂犬病病毒VP22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白单克隆抗体,将目的基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a-VP22原核表达质粒,并利用大肠杆菌表达系统,获得重组VP22蛋白。将纯化后的蛋白免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,通过杂交瘤细胞融合技术及间接ELISA方法筛选,经3次亚克隆后获得4株PRV VP22蛋白的单克隆抗体1D6、1D9、1B12和2C10。间接ELISA检测4株杂交瘤细胞传至15代均能稳定分泌抗体,且细胞上清液抗体效价均为1∶6400。经亚型鉴定,4株单克隆抗体的重链均是IgG1亚类,轻链皆属于κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的单克隆抗体均可与PRV发生特异性反应,并鉴定出2个抗原表位;Western blot和共聚焦试验结果表明,VP22蛋白是病毒早期蛋白,且早期存在于细胞质,晚期移位至细胞核并在核中积累。本研究制备的单克隆抗体将为后续探索PRV VP22蛋白的功能提供材料支撑。

猪伪狂犬病病毒BJC变异株分离鉴定及gB和gE基因序列分析

为了确定伪狂犬病疑似发病猪场PRV变异株病原及其病毒分子特征,通过病理剖检、病毒分离鉴定与纯化、ST细胞TCID_(50)和小鼠LD_(50)测定,对分离鉴定的病毒gB、gE基因进行PCR扩增、回收、克隆和测序,用生物信息学分析软件Geneious Prime对gB、gE基因进行遗传进化和同源性分析。结果显示,该分离株为PRV强毒株。该病毒在ST细胞生长良好,纯化后的病毒经测定半数组织培养感染量为10^(8.5)TCID_(50)/mL,对6周龄昆明小鼠的LD_(50)为10^(5.8)TCID_(50)。测序结果与预期的PRV gB、gE基因片段相符。遗传进化分析可知与国内代表PRV变异毒株如JS2012、HN1201、ZJ01等处于同一分支,与欧美分离株如Bartha、Kaplan、Becker等亲缘关系较远,处于不同的大分支。氨基酸序列分析表明,BJC株与国外经典毒株和国内早期分离毒株存在多个特征性位点替换,符合国内流行变异毒株特征,BJC株为PRV变异毒株。

2022—2023年新疆部分地区猪伪狂犬病毒抗体检测及分析

试验旨在了解2022—2023年新疆部分地区猪群中伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染情况和免疫抗体水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对新疆6个地区13个规模化养猪场的510份血清样品分别进行了PRV-gE和PRV-gB两种蛋白的抗体检测。结果显示,2022—2023年,新疆部分地区的猪群平均PRV-gE蛋白抗体阳性率为21.76%(111/510),不同地区与不同规模化养殖场间的平均PRV-gE蛋白抗体阳性率存在较大的差异。新疆地区规模化猪场平均PRV免疫抗体阳性率为59.41%(303/510),低于国家规定标准(70%),仅有38.46%(5/13)的猪场免疫抗体阳性率达到了国家规定标准,不同地区与不同规模化养殖场间的PRV免疫抗体阳性率存在较大的差异。研究表明,2022—2023年新疆部分地区PRV野毒感染率仍处于较高水平,免疫合格率较低,存在较大的风险,需加强对PRV的免疫防控工作。

猪伪狂犬病毒抗体检测方法的研究进展

伪狂犬病,也称阿氏病(Aujeszky'sdisease),是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种高度传染性疾病。在没有特定宿主的情况下,伪狂犬病毒可以侵入多种哺乳动物,包括猪、牛、羊等,从而导致易感动物发生严重的临床症状和急性死亡。我国于20世纪50年代首次报道猪伪狂犬病,且自2011年以来,部分地区出现新的猪伪狂犬病变异株,致使养猪业遭受严重的经济损失。尽管科学家们一直在致力于诊断方法的设计和相关疫苗的开发,但伪狂犬病仍在养猪业广泛存在,近些年发现其对人类的健康也存在着潜在威胁,从而引起了世界范围内的强烈关注。目前我国的猪场普遍实行伪狂犬疫苗免疫,因此检测免疫后疫苗产生的抗体水平至关重要。本文总结目前对PRV的抗体检测方法,针对其优缺点进行对比分析,以对猪场临床上选择抗体检测方法提供参考。

猪伪狂犬病病毒gG、gE和TK基因多重PCR检测方法的建立及应用

建立准确鉴别猪群伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)野毒株和基因缺失疫苗株高效多重PCR方法,对PRV gG、gE和TK基因保守区域设计合成特异性引物,优化反应体系和条件,建立多重PCR鉴别检测方法,对临床样品进行检测应用。结果成功建立了鉴别PRV gG、gE和TK基因缺失疫苗株和野毒株感染的多重PCR检测方法,该方法对PRV gG、gE和TK基因可进行特异性扩增,对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪副猪嗜血杆菌等相关病原均无扩增,对携带gG、gE和TK混合阳性质粒的最低检测限为2.5×10^(-5) ng/μL,具有良好的重复性。用该方法检测53份猪组织样品,检出PRV野毒感染的样品7份,与国标方法和单一PCR法检测结果符合率为100%。建立的猪伪狂犬病病毒野毒株和基因缺失疫苗株多重PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在生产中可快速、高效鉴别猪群PRV野毒感染和基因缺失疫苗免疫,可为PRV的快速鉴别检测、流行病学调查和防控提供技术支持。

鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了进一步掌握猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗的免疫接种效果,并构建合理的免疫接种程序,使用国产猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗,并选择4种不同的免疫接种程序制定4个处理组别,并设计了对照组,对250头繁殖母猪和200头种公猪以及1000头仔猪分别进行免疫接种试验并进行抗体检测,证明疫苗的免疫效果。结果表明,本次所使用的疫苗均能够产生良好的免疫保护效果,无论是跟胎免疫还是1年2次免疫,或者每间隔4个月进行免疫,均能够取得良好的免疫接种效果,种猪的免疫抗体合格率达到100%,仔猪在49日龄前抗体合格率也能够达到100%。75日龄之后,仔猪的抗体呈现逐渐消失的态势,120日龄基本消失。在今后猪伪狂犬病疫苗免疫接种过程中,为了增强猪群的免疫能力,避免野毒株传入,建议仔猪在首次免疫接种之后进行第2次强化免疫接种,而种公猪和繁殖母猪在春秋两季进行免疫接种之后,若不给仔猪进行免疫,仔猪在35日龄之后抗体水平会逐渐下降,直到全部为阴性,不能够抵抗野毒株的侵袭,因此该种方法不宜推广应用。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速的猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒抗体检测方法,试验采用原核表达技术对PRV流行毒株的gE蛋白进行了原核表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA检测方法。结果表明:获得了以包涵体形式表达的重组gE蛋白,经Western blot鉴定表明重组gE蛋白具有良好的免疫学活性,以该蛋白作为包被抗原建立的检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法检测PRV疫苗免疫血清、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV、FMDV阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的最低检出效价为1∶10240,批内和批间重复性试验的变异系数分别为2.19%~3.33%和3.01%~4.40%,与国外商品化gE-ELISA试剂盒的符合率达98.72%,应用该ELISA检测河南省部分地区采集的1128份猪血清样品,PRV野毒抗体阳性率为8.07%。说明建立的PRV野毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为PRV野毒抗体的流行病学监测和净化提供了技术支持。

河南省猪伪狂犬病病毒野毒感染血清学调查及gE基因遗传变异分析

【目的】调查河南省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒流行特征及遗传变异情况。【方法】用ELISA法检测2020-2021年从河南省766个不同养殖规模猪场采集的25411份血清样本的gE抗体水平;采用PCR法对从47个猪场疑似PRV感染猪群中收集的251份病料进行gE基因扩增,并将阳性病料样品接种ST细胞进行病毒分离、gE全基因测序和遗传进化分析。【结果】血清样品gE抗体总阳性率为18.42%,从2020年的20.32%降至2021年的16.69%,猪场阳性率为50.26%。随着猪场规模增大,猪场阳性率、血清样本阳性率呈下降趋势;商品代养殖场、屠宰场和种猪场的场阳性率、血清样本阳性率依次降低;豫东、豫西、豫南、豫北和豫中血清gE抗体阳性率分别为15.05%、23.48%、16.50%、16.69%和20.10%,1-3月阳性率最高,10-12月最低。组织病料样品中PRV阳性率为15.14%(38/251),从PRV阳性病料样品中共分离出9株PRV分离株。gE全基因序列遗传进化分析结果显示,分离株都属于GenotypeⅡ型,且猪群中既有PRV经典株也有PRV变异株。【结论】河南省猪场中仍然存在PRV感染,且同时存在PRV经典株和PRV变异株,本研究结果为河南省猪伪狂犬病的防控与净化提供参考依据。

河南某规模化猪场猪伪狂犬病病毒抗体检测与分析

为了解河南某规模化猪场猪伪狂犬病免疫程序的合理性和免疫效果,采用ELISA方法对该猪场235份血清样品进行PRV-gB、PRV-gE抗体检测与分析。结果显示:母猪、公猪以及20周龄的猪PRV-gB抗体阳性率为100%,10周龄猪为26.32%,其它周龄在81.81~94.44%之间;10周龄猪的PRV-gB抗体离散度最高为76.15%,20周龄猪最低为12.43%,其它周龄在15.08~64.53%之间。公猪PRV-gE抗体阳性率为11.11%,1~2胎母猪阳性率为2.94%,20周龄的猪阳性率高达30%。该猪场整体免疫效果较好,但抗体离散度差异大,不同阶段猪群整体抗体水平不太稳定,猪场存在野毒感染的情况。因此,该猪场应结合抗体检测结果及时调整免疫程序,提高免疫效果。

基于量子点技术的猪伪狂犬病病毒gB抗体免疫层析试纸研究

【目的】建立一种基于量子点(quantum dots,QDs)技术的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gB抗体免疫层析试纸,为PRV疫苗免疫效果评估提供一种快速、简便的检测技术。【方法】选用昆虫细胞表达系统表达的gB蛋白,采用羧基修饰的水溶性QDs,在偶联剂1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下制备gB-QDs荧光标记物。将金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus protein A,SPA)和抗gB蛋白的单克隆抗体分别固定在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,将样品垫、标记垫、吸水垫、支撑底板按生产工艺组装成基于QDs的荧光免疫层析试纸。检测该试纸的特异性、敏感性及与商品化ELISA试剂盒的符合率。【结果】敏感性试验结果显示,该试纸的敏感性为1∶6400。特异性试验结果显示,该试纸与猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清均无交叉反应,特异性为100%。通过检测田间猪血清样品,对比商品化ELISA检测试剂盒,结果显示,113份田间猪血清样品中,两种方法检测结果不一致的血清有11份,结果一致的血清有102份,该试纸与商品化ELISA试剂盒的符合率为90.3%。【结论】本研究制备的试纸检测线紫外灯下显色清晰可见,辨识度高,具有较高的特异性和敏感性,可用于PRV gB抗体的检测。

贵州省黔东南州规模猪场猪伪狂犬病gE抗体检测

系统了解了贵州省黔东南州规模猪场猪伪狂犬病gE抗体的阳性率,为其净化做准备。应用ELISA方法对2022年采集全州不同规模猪场的血清样品进行检测。发现规模猪场的猪伪狂犬病gE抗体阳性率不同季度处于20.99%~35.29%之间、不同生长阶段猪群在7.34%~46.10%之间、不同饲养条件下介于10.61%~45.41%内。结果表明,贵州省黔东南州中小型规模场(合作社)、第三季度和哺乳仔猪伪狂犬病gE抗体阳性率最高。在以后的防控中,应加强种猪伪狂犬病的净化,养殖场做好灭鼠和灭蚊等生物安全措施,同时建议对猪伪狂犬病gE抗体阳性的规模猪场进行疫苗免疫接种。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白的真核表达及其活性鉴定

为制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gE重组蛋白并评估其抗原活性,将优化的PRV gE基因胞外区插入真核表达载体pCMV并在其C端加入Hexa-His标签,构建真核表达质粒pCMV-gE;将重组质粒转染HEK293F细胞,Dot blot鉴定转染细胞中gE重组蛋白的分泌表达;利用镍亲和层析和凝胶过滤层析从转染细胞培养上清中纯化gE表达蛋白;以SDS-PAGE和Western blot鉴定gE重组蛋白,利用PRV阳性血清以ELISA分析gE重组蛋白的抗原活性,通过去糖基化酶PNGase F鉴定其糖基化修饰及其对抗原活性的影响。Dot blot结果显示,gE重组蛋白通过自身信号肽实现在细胞培养上清的分泌表达,其表达量在转染96 h达到峰值。SDS-PAGE和Western blot结果显示,从细胞培养上清中纯化获得gE重组蛋白纯度约为90%,经去糖基化酶PNGase F处理的gE重组蛋白分子质量显著降低。间接ELISA结果显示,gE重组蛋白检测PRV阳性血清的抗体效价为1∶12800;PRV阳性血清对gE蛋白的检出限为31.25 ng/mL,其抗原活性是原核表达的4倍。对临床血清的检测结果显示,基于gE重组蛋白的ELISA与IDEXX抗体检测试剂盒的符合率为96.5%。综上,在真核细胞中分泌表达了具有高表达量、高纯度、高活性和糖基化修饰的gE重组蛋白,在PRV感染鉴别检测中具有良好的应用潜力。

伪狂犬病病毒TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪毒力稳定性检测

旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临床症状,鼻腔排毒3~6 d,免疫后7、14、21 d,猪脑组织检测到PRV,其他组织均无病毒。仔猪滴鼻和肌肉注射F5、F30和F35代次ZJ01R病毒液,体温正常,无明显临床症状和病理变化,无病毒血症,鼻腔排毒时间仅为6 d;仔猪接种后7和14 d,肝脏和肺脏组织病毒检测均阴性,脑组织病毒核酸阳性;感染仔猪血清PRV gB ELISA抗体阳性,gE ELISA抗体阴性,表明ZJ01R毒株35代内对仔猪无临床致病作用,病毒毒力稳定性较好。