潜在转化生长因子β结合蛋白4影响肿瘤细胞伪足形成抑制结直肠癌转移的分子机制研究

目的 探究潜在转化生长因子β结合蛋白4(latent transforming growth factor beta binding protein 4,LTBP4)通过影响肿瘤细胞伪足形成从而遏制结直肠癌细胞转移的分子机制。方法 在结直肠癌细胞株DiFi中使用小干扰si-LTBP4敲减LTBP4,在结直肠癌细胞株HCT15中使用LTBP4过表达质粒过表达LTBP4。使用人源慢病毒在DiFi细胞株中稳定敲减/不敲减LTBP4构建稳转细胞株shLTBP4和shNC。Western blot法检测LTBP4、原肌球蛋白4(tropomyosin 4,TPM4)、金属基质蛋白酶14(matrix metalloproteinase-14,MMP14)及酪氨酸激酶底物5(tyrosine kinase substrate 5,TKS5)等蛋白。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测LTBP4及TPM4的表达。Transwell迁移实验检测敲低/过表达LTBP4后结直肠癌细胞的体外转移能力。使用裸鼠尾静脉注射shLTBP4或shNC稳转细胞株构建裸鼠肺转移模型及阴性对照,检测结直肠癌细胞敲减LTBP4后的体内转移能力。转录组测序检测差异基因表达情况。鬼笔环肽染色观察敲低LTBP4后细胞骨架改变及侵袭性伪足形成情况。结果 qPCR实验检测发现,LTBP4在DiFi、HCT8和KM12C细胞株中均高表达(均P<0.05),在HCT15和KM12SM细胞株中均低表达(均P<0.01)。Westen blot检测发现,LTBP4在DiFi、HCT8和KM12C细胞株中均高表达(均P<0.01),在HCT15、KM12SM及RKO细胞株中均低表达(均P<0.05)。在高表达LTBP4的DiFi细胞株中转染小干扰si-LTBP4,敲低LTBP4,转染后72 h后进行transwell迁移实验发现,肿瘤细胞迁移能力增强(P<0.01);而在低表达LTBP4的HCT15细胞株中过表达LTBP4,72 h后肿瘤细胞迁移能力减弱(P<0.01)。裸鼠肺转移模型在通过尾静脉注射稳转细胞株shLTBP4以及shNC 5周后进行小动物活体荧光成像发现,敲减LTBP4后,小鼠肺部荧光信号增强(P<0.01)。高通量转录组测序发现,在DiFi细胞株中敲减LTBP4使细胞骨架蛋白TPM4的表达量增加(P<0.01),维持细胞运动功能(如肌动蛋白丝束收缩、应力纤维改变和肌动蛋束的调节)相关通路显著富集(均P<0.05)以及细胞形态改变相关通路(如轴突伸展调节、突触前膜、核孔和活性离子跨膜传输等)显著富集(均P<0.05)。Western blot、qPCR及免疫荧光实验验证DiFi细胞株中敲减LTBP4促进细胞运动相关蛋白TPM4的表达(均P<0.01)。结论 LTBP4可以通过调控TPM4的方式抑制侵袭性伪足的形成从而遏制结直肠肿瘤细胞的转移。

A549细胞中DBNLS232磷酸化调控丝状伪足形成及细胞迁移运动

目的分析脑发育调节蛋白样蛋白(Drebrin-like,DBNL)对肺腺癌细胞迁移运动的影响,及其特异位点磷酸化修饰在丝状伪足形成中的作用。方法基于shRNA表达载体建立稳定敲减DBNL表达的A549细胞,分析其对癌细胞迁移运动的影响;综合利用在线蛋白质组数据库、定点突变和间接免疫荧光分析A549细胞中过表达野生型DBNL及3个位点突变型(S146E、T165E、S232E和S232A)对微丝骨架形态、丝状伪足形成及细胞迁移运动的影响;通过免疫沉淀实验确定A549细胞中S232位点发生磷酸化修饰。结果肺癌细胞中稳定敲减DBNL表达显著抑制细胞迁移运动(P<0.001)。通过CPTAC蛋白组数据库分析发现,肺腺癌样本中相较于癌旁组织DBNL蛋白水平表达差异不明显(P>0.05);但3个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点S146、T165和S232修饰化水平明显上调(P<0.001)。野生型及模拟磷酸化突变体S146E、T165E、S232E过表达在A549细胞中,免疫荧光检测发现S232E富集于膜周凸起,且显著促进癌细胞丝状伪足形成(P<0.001);而表达磷酸化失活型S232A则诱导其弥散状分布在细胞质中,并抑制丝状伪足形成(P<0.01)。最后利用免疫共沉淀及通用型丝氨酸磷酸化抗体证明A549细胞中DBNL的S232位点被磷酸化修饰;并基于在线磷酸化序列激酶预测分析发现,p38和CDK5等激酶是S232位点的潜在修饰激酶。结论肺腺癌细胞A549中磷酸化DBNLS232调控丝状伪足形成并促进细胞迁移运动。

人源Krt5促进斑马鱼成纤维细胞丝状伪足形成和伤口愈合

目的:探究斑马鱼角蛋白Krt5和M1/M2型巨噬细胞极化因子调节斑马鱼下颌和心脏芽基可塑性再生过程的机制。方法:在斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2中过表达人源Krt5,添加4个代表性的巨噬细胞极化因子蛋白。在检测蛋白表达情况后,免疫荧光法观察Krt5和F-actin在PAC2细胞的分布变化;细胞划痕实验检测PAC2细胞迁移能力;转录组测序和免疫沉淀-质谱(IP-MS)分析Krt5调控网络。结果:Krt5围绕着细胞核,在胞浆成束成网分布并扩展到细胞质膜;过表达Krt5增加鬼笔环肽标记的F-actin代表的细胞丝状伪足形成,并加快细胞迁移愈合;转录组分析显示,Krt5明显增加Rac2/Rhov、NF-κB、Mylkb、Ifnphi1、IL-13和IL-11的转录,降低多个胶原蛋白、肌动蛋白和TGF-β家族基因转录,同时IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10诱导处理总体上与Krt5作用一致;IP-MS证实Krt5与α-辅肌动蛋白(Actn1)和非肌肉肌球蛋白重链(Myh9b,Myh10)紧密结合。结论:Krt5可能通过与肌动蛋白相互作用激活Rac/Rho机制从而促进细胞生成丝状伪足,重塑细胞因子受体结构与巨噬细胞极化因子的相互作用。

黄芩苷通过降低活性氧生成抑制血管平滑肌细胞伪足形成和迁移

已知黄芩苷(baicalin)通过削弱肌动蛋白相关蛋白(actin-related protein,Arp)2/3复合物的活性抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)伪足形成和迁移,然而,其抑制该信号途径的机制尚不明确。本研究证明,黄芩苷通过抑制VSMC活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成降低Arp2/3活性,发挥阻止细胞伪足形成和迁移的功能。分别利用TRITC-鬼笔环肽和ROS荧光探针标记VSMCs,结果显示,黄芩苷能显著抑制血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-BB诱导的VSMC伪足形成和迁移,伴有ROS生成减少。用超氧物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)清除胞内过氧化物后,PDGF-BB引发的VSMC伪足形成被逆转,且该过程与降低皮层肌动蛋白微丝(F-actin)成核蛋白Arp2/3活性有关。免疫沉淀分析结果进一步表明,黄芩苷降低p47phox磷酸化水平,与ROS生成减少相一致。体内的实验也表明,黄芩苷(70 mg/kg/d)能有效抑制球囊损伤诱导的大鼠颈总动脉ROS生成。以上结果表明,黄芩苷通过抑制NADPH氧化酶介导的ROS生成,降低细胞皮质区F-actin成核活性,阻止细胞伪足形成、迁移,进而发挥血管保护作用。

小檗碱通过Ezrin蛋白抑制鼻咽癌细胞迁移和伪足形成

目的观察小檗碱（Berberine，BBR）对鼻咽癌细胞埃兹蛋白（Ezrin）和磷酸化埃兹蛋白（phos-Ezrin）表达的影响以及其对细胞伪足形成和迁移的抑制作用，探讨BBR抗鼻咽癌转移可能的分子机制。方法以体外培养的鼻咽癌细胞株（CNE1）为研究对象，用MTr法分析BBR对CNE1细胞生长的影响，选用BBR细胞无毒性浓度（non-cytotoxic concentration，NCC）进行实验。免疫印迹（Western-blotting）分析CNE1Ezrin和phos-Ezrin的表达。用光镜CNE1观察细胞迁移能力，电子显微镜观察细胞伪足形成。Ezrin小干扰RNA（Ezrin-siRNA）转染阻断Ezrin蛋白表达，进一步确证BBR通过Ezrin抑制细胞伪足形成。结果MTT结果显示，BBR在5μM以上明显抑制CNE1增殖（P〈0．05），浓度（0—5）州对CNE1细胞生长增殖抑制作用不明显，为BBR对CNE1的细胞无毒性浓度（NCC）。BBR在NCC能明显抑制CNE1细胞phos-Ezfin表达，且呈浓度依赖性。光镜观察显示BBR对CNE1细胞迁移有明显的抑制作用。电镜观察结果显示，BBR抑制CNE1细胞伪足形成。结论BBR可能通过抑制Ezfin磷酸化而抑制鼻咽癌CNE1迁移。

壮骨镇痛胶囊含药血浆培养乳腺癌细胞rac-1,PI3-K转录和细胞伪足的变化

背景:前期实验已证实壮骨镇痛胶囊能显著抑制体外培养乳腺癌细胞的迁移和增殖。目的:进一步观察壮骨镇痛胶囊对高转移人乳腺癌MDA-MB-231细胞rac-1,PI3-K转录和细胞伪足生长的影响。方法:SD大鼠以3倍剂量灌服壮骨镇痛胶囊连续7d,以大鼠含药血浆培养MDA-MB-231细胞24h后,采用扫描电镜法观察不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞伪足生长的影响,采用RT-PCR法检测含药血浆对MDA-MB-231细胞中rac-1,PI3-K转录的影响。结果与结论:5.0%和1.25%壮骨镇痛胶囊含药血浆能显著抑制MDA-MB-231细胞伪足的形成和生长以及rac-1和PI3-K基因的转录(P<0.05);0.63%壮骨镇痛胶囊含药血浆对伪足生长和rac-1基因转录无显著影响,但可显著抑制了PI3-K基因的转录(P<0.05)。由此推测壮骨镇痛胶囊含药血浆抑制MDA-MB-231细胞迁移可能与其抑制rac-1和PI3-K基因转录进而影响细胞伪足形成和生长密切有关,并且该作用可能与浓度相关。

稳定转染NOR1抑制5-8F细胞片状伪足形成和Wnt信号通路

细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网络结构,不仅与保持细胞形态结构有关,而且影响细胞黏附和细胞运动.NOR1是从鼻咽癌中克隆得到的新基因,在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调.本研究建立了NOR1稳定表达的鼻咽癌5-8F细胞系.过表达NOR1引起高转移性鼻咽癌5-8F细胞形态改变,抑制片状伪足形成、细胞表面积缩小、细胞聚集性增强.扫描电镜检测发现,NOR1抑制了5-8F细胞膜微绒毛的数量,引起细胞膜表面改变.细胞骨架染色发现,NOR1过表达导致5-8F细胞actin骨架连续性破坏,应力纤维增加.Realtime RT-PCR检测发现,NOR1引起5-8F细胞Wnt/β-catenin信号通路分子Wnt5A受体FZD5、FZD7表达下调,抑制了β-catenin蛋白入核.提示NOR1抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,破坏细胞骨架连续性,抑制细胞膜微绒毛与伪足形成.

大肠杆菌血脑屏障侵袭基因ibeB的稳定转染能够促进HeLa细胞片状伪足的形成

为进一步探讨大肠杆菌血脑屏障侵袭基因ibeB的生物学特性,将ibeB基因克隆至真核表达载体,采用稳定转染的方法,对ibeB基因在HeLa细胞中的表达所产生的影响进行了研究. 结果发现:经ibeB基因稳定转染的HeLa细胞向外周伸展,细胞骨架的组分——微丝发生了重新排布,形成了明显的片状伪足,细胞周边形成较多的膜皱褶结构;细胞对底物的粘附能力和伸展能力显著增强;细胞的粘着斑标志性蛋白Vinculin表达增强. 这些结果为研究片状伪足的形成机制提供了模型.

FAK/Paxillin信号通路参与调节乳腺癌细胞侵袭伪足形成

目的探讨FAK/Paxillin信号通路在体外培养乳腺癌细胞侵袭伪足形成中的作用。方法筛选P-FAK(Tyr397)抑制剂Y15适宜浓度,使之仅抑制FAK 397位酪氨酸磷酸化,不抑制FAK及细胞内其他基因表达;选用适宜浓度Y15抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中FAK磷酸化,采用原位明胶酶谱法检测侵袭伪足形成及细胞外基质降解能力;采用细胞黏附实验和侵袭小室实验检测MDA-MB-231细胞对细胞外基质的黏附和侵袭能力。结果 1μM Y15能显著抑制MDA-MB-231细胞中FAK 397位酪氨酸磷酸化和paxillin 118位酪氨酸磷酸化且不影响FAK和paxillin表达量;抑制MDA-MB-231细胞中FAK磷酸化能显著抑制细胞侵袭伪足形成,并抑制其细胞外基质降解能力;抑制MDA-MB-231细胞中FAK活化能显著抑制乳腺癌细胞对细胞外基质的黏附及向周围侵袭的能力。结论 FAK/Paxillin信号通路参与调节乳腺癌细胞侵袭伪足形成,促进肿瘤侵袭、转移。

6A8α-甘露糖苷酶表达抑制致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少

目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2细胞与层粘连蛋白的粘附及细胞表面片状伪足的影响。方法Western印迹检测6A8α-甘露糖苷酶的表达。置细胞于层粘连蛋白(laminin)包被的培养板孔中,37℃孵育1h后,用结晶紫染色细胞,用0.1mol/L枸橼酸钠/50%乙醇溶解结合到细胞中的染料。测定540nm处的吸光度值(AT),按R=AT/A100×100%计算粘附率(A100为100%粘附值)。扫描电镜观察细胞表面的片状伪足。结果6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的2个克隆细胞株(AS1和AS2)对层粘连蛋白的相对粘附率分别为0.447±0.096与0.533±0.065,而6A8α-甘露糖苷酶表达正常的对照细胞(W、M和S)的相对粘附率分别为0.78±0.035、0.7±0.05和0.80±0.04。两者的差别有生物学意义(P<0.01)。6A8α-甘露糖苷酶表达正常的细胞表面片状伪足丰富,6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞表面的片状伪足基本上消失。结论6A8α-甘露糖苷酶表达抑制可导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少。

伪足瘿螨亚科三新种记述(蜱螨亚纲:瘿螨科)

本文三新种是壳菜果伪足瘿螨Nothopoda mytibariae sp. nov., 木香新联节瘿螨Neocosella aquilariae sp. nov. 和荔枝离节瘿螨Disella litchii sp. nov., 它们都分布在广西。

益气解毒法不同组方对鼻咽癌细胞迁徙运动潜能及细胞伪足的影响

目的研究益气解毒法不同组方对鼻咽癌细胞迁徙运动潜能及其细胞伪足的影响。方法以正常大鼠血浆为对照,分别应用益气解毒方原方及其改方大鼠药物血浆对CNE2Z细胞进行干预,采用划痕实验法评价不同组方药物对靶细胞迁徙运动潜能的影响,以扫描电镜观察细胞伪足形态特征,分析靶细胞的反应特性。结果益气解毒原方对CNE2Z细胞的迁徒运动潜能显示抑制效应,细胞迁徙能力较差,伪足伸展不明显;益气解毒改方则对靶细胞迁徙运动潜能显示为促进效应,细胞伪足伸展长度较长。结论同为益气解毒法的组方,由于剂量构成比不同,各方对鼻咽癌细胞迁徙运动潜能的药效学差异巨大。这样的药理效应特点,对中药复方的合理组方提出了严格要求。

细胞伪足形成与微丝骨架研究进展

趋化是原生动物最基本、最原始的运动形式。目前,很多学者研究免疫细胞及癌细胞的趋化性,并揭示了伪足形成的主要机制,以及其形成与细胞骨架的关系。普遍认为,细胞伪足的形成源于其细胞骨架的重要作用。

中国伪足瘿螨亚科三新种记述(蜱螨亚纲,瘿螨科)(英文)

记述了伪足瘿螨亚科Nothopodinae3新种：黄葛树同足瘿螨Colopodacus virens sp.nov.,继木伪足瘿螨Nothopoda chinense sp.nov.,扁担藤分位瘿螨Disella planicaule sp.nov.。本文所用量度单位均为μm。模式标本保存在广西大学农学院。1 黄葛树同足瘿螨,新种Colopodacus virens sp.nov.（图1~6）新种与Colopodacus bangalensis Mohanasundaram,1981近似,但新种以背盾板图案前缘有1排小室,爪具端球等与后者区别。正模♀,副模： 12 ♀♀,2 ♂♂,叶背自由生活。寄主：黄葛树Ficus virens Corner. （桑科Moraceae）。欧善生、朱辉和王国全,2007-05-23 ,广西桂林市。2 继木伪足瘿螨,新种Nothopoda chinense sp.nov.（图7 -12）新种与Nothopoda wendlandiae Wei ＆ Qin2002近似,但新种以足基节光滑,背盾板两后角具6条弧线,羽状爪4支与后者区别。正模♀,副模： 15 ♀♀,3 ♂♂,叶背营自由生活。寄主：继木Loropetalum chinense Oliver（金缕梅科Hamamelidaceae）。欧善生、朱辉和王国全,2007-05-23 ,广西桂林市。3 扁担藤分位瘿螨,新种Disella planicaulesp.nov.（图13-18）新种与Disella cylindrokeluphae Wei,Xie ＆ Chen2006近似,但新种以羽状爪5支,基节Ⅰ有刻点,大体背中脊后背环为弓形,生殖盖片光滑与后者相区别。正模♀,副模： 9 ♀♀,3 ♂♂,叶背营自由生活。寄主：扁担藤Tetrastigma planicaule Gagnep. （葡萄科Vitaceae）。欧善生、朱辉和王国全,2007-05-23 ,广西桂林市。

中国伪足瘿螨亚科一新属三新种记述(蜱螨亚纲:瘿螨科)

记述伪足瘿螨亚科的1新属:新分位瘿螨属Neodisellagen.nov.,及3新种:菝葜新分位瘿螨Neodisellasmilacaceaesp.nov.,楝叶吴茱萸分位瘿螨Disellameliifoliaesp.nov.,须花藤分位瘿螨Disellalaurifoliussp.nov.。

白假丝酵母菌伪足现象的鉴定

目的伪足法用于白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌鉴别的临床评价。方法将标本接种于巧克力平板,5%CO2、37℃培养48h,观察菌落周围是否出现伪足,并以标准方法确认。结果 181株白假丝酵母菌中,169株出现伪足现象;55株热带假丝酵母菌中4株出现伪足现象;8株克柔假丝酵母菌中,2株出现伪足现象。以"伪足现象"鉴定白假丝酵母菌的灵敏度为93.4%(95%CI:88.8%～96.2%),特异度为95.2%(95%CI:89.9%～97.8%)。结论伪足法鉴定白假丝酵母菌具有简单、经济、快速的特点,有较高的灵敏度和特异度,适宜推广应用。

血清诱导95D细胞中Nm23H1从细胞质转位至细胞膜板状伪足

目的 探索Nm2 3H1(肿瘤转移抑制因子之一)在细胞内的定位与其功能关系。方法 以人肺巨细胞癌95D细胞为模型,在血清饥饿2 4h后加入血清,观察细胞形态变化及Nm2 3H1在细胞内的分布变化。结果 血清刺激可以诱导95D细胞形成板状伪足,细胞免疫荧光实验发现Nm2 3H1主要分布于细胞质,但在血清诱导形成的细胞板状伪足部位出现显著的Nm2 3H1分布。亚细胞组分分离及免疫印迹的实验结果也证实Nm2 3H1在血清刺激下可以转位到细胞膜,并且这种诱导作用是迅速的,在30min左右达到高峰,8h后降至仍然略高于血清诱导前的水平。结论 Nm2 3H1这种特殊的定位可能涉及细胞的运动,为进一步研究Nm2 3H1的功能与作用机制提供了基础。

天蓝喇叭虫的固着行为及伪足形成的观

为了观察和探讨天蓝喇叭虫的固着行为及固着机理在光学显微镜下对其进行了活体观察发现天蓝喇叭虫的固着结构位于虫体的后端，即细胞皮层纵向排列的纤毛动索的交汇位置，喇叭虫固着时在固着结构形成丝状伪足．本文首次报道的纤毛纲动物身体上出现了伪足这一现象，揭示了鞭毛纲。

趋化剂对细胞伪足极性生长的影响研究

为了解趋化性细胞逆趋化剂浓度梯度迁移的机理,用带有荧光标记的趋化剂(FITC-LPS)诱导了培养的中性粒细胞。发现中性粒细胞在靠近趋化剂的一侧的荧光比背离趋化剂一侧的荧光强,并朝趋化剂方向长出伪足移动。细胞在迎、背趋化剂两面与趋化剂结合浓度的差异导致细胞微丝组装的部位差异可能是造成伪足生长密度差异的原因,这一差异决定了细胞趋化运动的方向。