半滑舌鳎养殖群体中自然性逆转伪雄鱼的发现

利用雌性特异标记遗传性别鉴定技术,对71尾4龄半滑舌鳎的生理和遗传性别进行鉴定,结果显示32尾生理型雌鱼均能扩增出205bp的雌性特异条带;39尾生理型雄鱼,仅一尾鱼体重显著高于其他雄鱼并扩增出了雌性特异条带,因此这尾鱼遗传上为雌性,是一尾伪雄鱼。对养殖的600尾半滑舌鳎生理雄鱼大规模检测发现,养殖群体自然性逆转伪雄鱼比例为1.66%。对正常雌、雄鱼和1龄自然性逆转伪雄鱼的性腺组织学观察显示,与正常雄鱼相比,伪雄鱼性腺中也有大量的精母细胞,但数量比正常雄鱼的要略少;且未在伪雄鱼的性腺组织中观察到卵母细胞,说明半滑舌鳎性逆转发生在性腺分化期。半滑舌鳎自然性逆转现象的发现有助于解释当前半滑舌鳎养殖群体中雄性率偏高的现象,为半滑舌鳎全雌苗种生产提供了一条新的技术途径,并丰富了鱼类性别分化理论。

虹鳟伪雄鱼与正常二倍体群体血清类固醇激素含量的季节变化

用17ɑ-甲睾酮混合饲料投喂诱导2批虹鳟Oncorhynchus mykiss伪雄鱼(三、四龄,平均体质量分别为2 200 g和3 056 g),以正常二倍体群体为对照(三、四龄平均体质量2 510 g和3 600 g),采用组织学和放射性免疫(RIA)方法,每2个月采血一次研究伪雄鱼和正常二倍体血清中性类固醇激素雌二醇(E2)和睾酮(T)的周年变化。结果表明,正常虹鳟和伪雄鱼精巢的组织细胞结构没有明显差异,伪雄鱼性腺组织形态与卵巢相似。3龄和4龄伪雄鱼血清中E2含量均在12月达到峰值,而3龄鱼的T浓度在12月达到峰值,4龄则在翌年2月达到峰值;3龄雌鱼血清中E2含量在10月达到峰值,4龄则在8月达到峰值,而T浓度均在12月达到峰值,进入繁殖期后E2含量开始下降;3龄和4龄正常雄鱼血清T浓度均在12月达最大值,E2在10月达峰值。结果表明,测定血清性类固醇激素浓度可用于准确判断鱼类的生殖状态,为正确利用虹鳟伪雄鱼提供参考。

金鳟伪雄鱼的制备及全雌三倍体的诱导

以4龄金鳟Oncorhynchus mykiss为试验鱼（雄、雌性平均体重分别为1．7、2．2kg），采用人工诱导雌核发育技术灭活金鳟精子，对受精卵进行热休克处理后正常孵化，获得初孵仔鱼；再用雄性激素诱导全雌二倍体，得到性逆转雄鱼（伪雄鱼）；培育至性成熟后进行人工繁殖，采用热休克法对受精卵进行处理获得全雌三倍体鱼类。结果表明：金鳟全雌二倍体的诱导出现率为80％，金鳟伪雄鱼获取成功率为75％；用不同pH人工精浆激活伪雄鱼精巢精子，高pH（9—10）的人工精浆激活受精卵的效果最好，金鳟三倍体的出现率为75％-80％，其中还有一定比率的嵌合体出现。

Sox9和amh基因在雌、雄虹鳟和伪雄鱼各组织中的表达模式分析

本研究利用Real-timePCR分析和比较sox9与amh基因在雄、雌虹鳟Oncorhynchus mykiss及及其伪雄鱼各组织中的表达模式。结果表明:sox9基因在这三种鱼性腺、脑、脾、肝以及脑垂体中的表达显著高于其他组织(P<0.05)。在性腺组织中,sox9基因在雄鱼中的表达量显著高于伪雄鱼(P<0.01),而在伪雄鱼中的表达量又显著高于普通雌鱼(P<0.01)。脑组织中,雌鱼sox9的表达显著高于雄鱼和伪雄鱼(P<0.05)。Amh基因在性腺和脑组织中的表达显著高于其他组织(P<0.05)。该基因在伪雄鱼性腺和脑中的表达均显著高于雄鱼和雌鱼(P<0.05)。结果表明,外源雄激素的诱导可导致伪雄虹鳟性腺和脑组织中sox9和amh基因的表达显著高于雌性虹鳟,促进其性腺的雄性化发育。本研究可为全雌性虹鳟制种技术研究奠定重要理论基础。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)真、伪雄鱼群体表型和遗传性状分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)养殖群体中存在真雄鱼(ZZ)和伪雄鱼(ZW)现象,进行表型和遗传特征研究对其育种及优良苗种培育具有重要的意义。本研究以半滑舌鳎真、伪雄鱼群体及母系半同胞家系为研究对象,首先测定了性成熟半滑舌鳎的真、伪雄鱼群体的表型性状,对其性状进行了比较分析。结果显示,性成熟半滑舌鳎真、伪雄鱼的体重、全长、体长、体宽、头长、眼间距和眼径7个表型性状都存在极显著差异(P<0.01),伪雄鱼的生长速度比真雄鱼快。利用半滑舌鳎22对多态性微卫星标记,对2组半滑舌鳎真、伪雄鱼半同胞家系群体进行了遗传多样性分析。筛选出的22对引物扩增产物均具有多态性,4个半同胞家系群体中共检测到232个等位基因,群体平均等位基因数(N_a)均大于平均有效等位基因数(N_e);平均观测杂合度(H_o)均小于平均期望杂合度(H_e);平均多态信息含量(PIC)分别为0.4566、0.4254、0.5069、0.4795。22个多态性位点在4个半同胞家系群体中分别有3、3、4和5个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。4个半同胞家系群体间的Nei￠s遗传距离为0.2101–0.5840,遗传相似性系数为0.5577–0.8105。本研究表明,半滑舌鳎真、伪雄鱼在生长性状上存在明显差异,同母系的真、伪雄鱼半同胞家系群体间的遗传相似系数较高,遗传距离较小,遗传多样性指标相近。

半滑舌鳎伪雄鱼性腺发育的组织学研究

[目的]了解半滑舌鳎性逆转的生理发育过程。[方法]对5个家系的半滑舌鳎进行性腺发育的组织学观察、遗传性别鉴定和生理性别分析。[结果]半滑舌鳎性逆转有着明显的群体性,性逆转只发生在特定群体中,有些群体完全不逆转;半滑舌鳎发生逆转的遗传雌鱼在性腺发育过程中,会出现明显的兼性阶段,即雌雄兼有的特有过程。[结论]该研究结果可为剖析半滑舌鳎性逆转的分子、生理机理以及性逆转遗传因子的作用机理提供研究方向和研究线索。

黄颡鱼XX伪雄鱼诱导与全雌种群规模化繁育

研究利用3种雄性化因素,包括17α-甲基睾丸酮(MT,5 mg/kg)、来曲唑(LZ,300 mg/kg)和高温(33.5℃)联合处理12—65日龄黄颡鱼幼鱼,并将性成熟的XX伪雄鱼与正常XX雌鱼进行人工繁殖,开展了全雌黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)规模化繁殖与苗种培育工作。研究发现,MT、LZ和高温共同作用可诱导XX黄颡鱼逆转为生理型雄性,完全性逆转个体运动型精子比例与XY雄鱼无显著性差异,组织学切片也显示其精巢中存在大量精子细胞,推测XX伪雄鱼具有正常的繁殖功能。随后,以XX伪雄鱼为父本,正常XX雌鱼为母本开展了规模化人工繁殖,获得了57万尾基因型全部为XX的黄颡鱼苗种,并将其成功培育成大规格鱼种。在幼鱼60日龄和120日龄时取样发现,分别有2.8%和12.0%的个体发生了不同程度的雄性化,推测其可能受到池塘自然高温的影响而发生了性逆转。其余XX雌鱼卵巢发育良好,来年繁殖季节可作为规模化人工繁殖的雌性亲本。研究成功开展了全雌黄颡鱼规模化繁育工作,为全雌黄颡鱼规模化繁育体系的建立提供了基础,也为黄颡鱼新品种选育中雌性选育提供了保障。

左炔诺孕酮对XX遗传型黄颡鱼雄性化的影响

为高效诱导功能性XX黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)伪雄鱼,研究以XX遗传型黄颡鱼为实验对象,以12日龄为左炔诺孕酮(Levonorgestrel, LNG)浸泡处理的起始点,设计高(1μg/L)、中(0.1μg/L)和低(0.01μg/L)浓度的LNG处理组,及对照(0)组,于60日龄处理结束。高、中、低浓度LNG处理组和对照组诱导雄性化比例分别为4.0%、25.0%、62.5%和0。观察性腺结构发现, 1和0.1μg/L处理组雄性化的精巢中只有全精巢型,0.01μg/L处理组则包括全精巢型(20.8%)和部分精巢型(41.7%)。幼鱼122日龄精巢组织学观察到大量精子和生精小管互通现象,推测诱导的XX伪雄鱼具有正常繁殖能力。未雄性化的卵巢发育受到LNG抑制, 62日龄卵母细胞数量和122日龄性腺指数分析结果表明,卵巢发育抑制程度与LNG处理浓度呈正相关。与对照组相比, LNG处理对黄颡鱼生长和死亡率都无显著影响。研究表明,在LNG诱导黄颡鱼雄性化研究中,具有雄性化诱导效率较高、使用剂量小和产生的伪雄鱼精巢发育易成熟的优势。研究为优化制备功能性伪雄鱼技术提供了新的思路,为黄颡鱼产业的可持续发展和新品种高效选育奠定了重要基础。

半滑舌鳎养殖群体的性比与雌雄形态差异比较

为研究半滑舌鳎养殖群体幼鱼阶段的性比变化,实验用分子标记法鉴定半滑舌鳎遗传性别,用组织切片方法鉴定表型性别,并比较了表型雌雄的生长差异。结果发现,在半滑舌鳎幼鱼阶段,在遗传性别上,雌雄所占比例约为1∶1,差异不显著(P>0.05)。在表型性别上,雌雄比例约为1∶3,差异极显著(P<0.01)。表型雄性中,由遗传性雄性和遗传上为雌性而表型上为雄性的"伪雄鱼"两部分组成。在养殖群体中,表型雌性、伪雄鱼和雄性三者的比例大致为1∶1∶2。养殖现场反映的雌性约占1/4的情况与本研究结果基本一致。本研究没有发现遗传上为雄性,而表型上为雌性的个体。在6～8月龄间,伪雄鱼的全长、体质量处于表型雌性与正常雄性之间,与两者均无显著差异。在相似全长范围内,雄鱼体高小于雌鱼,雄鱼的全长/体高的平均值为4.05,雌鱼的平均值为3.89,雄鱼的全长/体高比值显著大于雌鱼(P<0.05),此比值可以作为区分雌雄鱼苗种的参考。

半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。

半滑舌鳎Dmrt4基因DNA全序列的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt4基因DNA全序列,得到的序列长度为2 271 bp,包含1个内含子,2个外显子,与其他鱼类的同源性在90%以上。Dmrt4基因在雌性和雄性半滑舌鳎的7个组织中都有表达,有差异表达的组织是脑、垂体和性腺,雄性的表达显著高于雌性(P<0.05)。高温处理组的伪雄鱼中Dmrt4基因的表达与对照组的雌鱼没有显著差异(P>0.05),但是甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼的表达显著高于对照组的雌鱼和雄鱼(P<0.05)。Dmrt4基因的表达在胚胎发育过程中呈现先升高后降低的趋势,在原肠期表达量最高,显著高于其他几个时期(P<0.05),从尾芽形成期开始恢复到多细胞期的表达水平,之后几个时期Dmrt4基因的表达无显著变化(P>0.05),一直到出膜前保持恒定。研究表明,Dmrt4基因是雄性中优势表达的基因,并且受雄性基激素调节,但并不是性反转的必要因素。这一研究为半滑舌鳎全雌群体的建立提供了分子水平的研究基础。

鲆鲽鱼类发育异常的机制解析和防控技术建立

鲆鲽鱼类是我国重要的海水养殖鱼类,牙鲆、半滑舌鳎养殖过程中普遍存在白化、黑化等体色发育异常问题,严重影响鲆鲽鱼类的销售价格和市场销量,长期制约着鲆鲽类健康养殖持续发展。同时,半滑舌鳎养殖过程中性腺发育异常导致的大量伪雄鱼,生长缓慢,导致养殖产量低,严重影响了半滑舌鳎养殖业的发展。针对鲆鲽鱼类体色异常和半滑舌鳎伪雄鱼的频发,项目通过产学研合作,阐释了鲆鲽鱼类体色异常的机制,发现了半滑舌鳎伪雄鱼发生的分子基础,建立了完善的防控技术并示范应用,取得了较好的经济和社会效益。