伴放线放线杆菌与致龋菌生长关系的体外研究

目的:观察伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)与4种致龋菌,即变异链球菌(S.mutans)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、内氏放线菌(A.naeslundii)、粘性放线菌(A.viscosus)在体外共培养时相互间的生长抑制作用。方法:改良琼脂扩散法和双菌种液体培养观察A.actinomycetemcomitans与S.mutans、L.acidophilus、A.naeslundii、A.viscosus生长的相互关系;扫描电镜及菌落计数观察双菌种生物膜形态和细菌比例的差异。实验数据用SPSS10.0软件包进行两样本均数的t检验。结果:琼脂扩散法抑菌实验表明,A.actinomycetemcomitans对S.mutans、L.acidophilus、A.naeslundii、A.viscosus的生长无抑制作用,S.mutans、L.acidophilus、A.naeslundii、A.viscosus可抑制A.actinomycetemcomitans的生长。在双菌种液体培养中,A.actinomycetemcomitans所占比例随时间逐渐下降,差异具有显著性(P<0.05);A.actinomycetemcomitans培养12h后,所占比例呈下降趋势,24h在S.mutans和L.acidophilus组中的比例下降为0。生物膜的观察表明,单菌种A.actinomycetemcomitans成块状散在黏附,无完整生物膜形成,4种致龋菌在48h均形成结构完整的生物膜,具有三维立体结构。与单菌种相比,加入A.actinomycetemcomitans后,致龋菌的生物膜形态未发生明显改变。更换培养液后,A.actinomycetemcomitans在混合菌种生物膜中的比例仍随时间延长下降,72h降低到最低点,各时间点的差异具有显著性(P<0.05)。结论:体外培养4种致龋菌可抑制A.actinomycetemcomitans的生长。

采用PCR方法鉴别伴放线放线杆菌的6种血清型

目的:探索采用PCR的方法对伴放线放线杆菌的不同菌株进行血清型分类。方法:根据伴放线放线杆菌不同血清型特异性多糖抗原基因序列设计6对不同的寡核苷酸引物,用这6对引物分别对所选择伴放线放线杆菌6种不同的血清型菌株各3株,共18株,其中参考菌株6株,系ATCC29523(血清型a),ATCC43718(血清型b),ATCC33384(血清型c),IDH781(血清型d),IDH1705(血清型e)以及CU1000(血清型f),其余12个菌株均为临床分离株的DNA进行PCR扩增分析。结果:每一对引物均针对相应的血清型产生特异性单一条带PCR产物,产物大小分别为428bp(a),298bp(b),559bp(c),690bp(d),211bp(e),232bp(f)。全部18个菌株均能够被准确识别,无交叉反应。结论:PCR方法可以快速准确地鉴别伴放线放线杆菌目前已知的全部6种血清型。

伴放线放线杆菌与牙周病相关细胞凋亡关系的研究

牙周病是口腔的常见病和多发病,但其具体机制至今尚未完全明了。大量研究证实,细胞凋亡在牙周病的发生和发展过程中起重要作用。伴放线放线杆菌是牙周炎主要致病菌之一,可产生多种毒力因子。本文就伴放线放线杆菌的各种毒力因子与细胞凋亡及伴放线放线杆菌与牙周组织内多种细胞凋亡的关系进行综述。

伴放线放线杆菌cdtC基因的克隆及其原核表达载体pET15b-cdtC的构建

目的:本实验设计克隆Aa CdtC亚基蛋白的编码基因cdtC并构建其原核表达载体pET 15b-cdtC,为研究CdtC亚基对CDT全毒素功能的分子机制奠定基础。方法:厌氧培养Aa ATCC 29523,提取Aa基因组DNA,PCR反应扩增cdtC基因片段。将此片段克隆入pMD 19-T Vector,经限制性内切酶BamHI和Xho I酶切得到粘性末端cdtC片段,克隆入原核表达载体pET 15b中。结果:产物经PCR初步鉴定后进行DNA序列分析,测序结果与Genbank公布序列一致性达100%。结论:本实验成功克隆了cdtC基因,并成功构建了其原核表达载体pET15b-cdtC。为深入研究CdtC亚基以及CDT全毒素分子作用机制奠定基础。

伴放线放线杆菌flp-1基因遗传多样性分析

目的 :分析伴放线放线杆菌 (Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa)临床分离菌株菌毛结构基因flp 1的遗传多样性和flp 1基因与菌株表型之间的关系。方法 :对从不同牙周状况患者口腔中分离的 6 0株Aa(5 7株粗糙型 ,3株传代转变成光滑型 )和 6株Aa标准菌株 (光滑型 )进行flp 1基因扩增 ,并通过PCR限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)法分析临床分离菌株flp 1基因的遗传多样性。结果 :所有 5 7株粗糙型菌株和 9株光滑型菌株都检测到flp 1基因 ;6 0株临床分离菌株检测到 5种flp 1基因型 ,其中基因型 2型占 6 7% ,共有 4 0株。结论 :Aa菌株表型的改变不伴有flp 1基因缺失 ;Aa临床分离菌株flp 1基因具有遗传多样性 ,基因型主要为

伴放线放线杆菌对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究伴放线放线杆菌对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。方法:采用细胞计数法分析伴放线放线杆菌对干细胞增殖的影响。应用免疫细胞化学法检测干细胞表面标记物和骨桥蛋白的表达,RT-PCR法检测C-myc、Klf4、Col1和Runx2 mRNA的表达,利用试剂盒检测干细胞碱性磷酸酶的变化,分析伴放线放线杆菌对干细胞干性和成骨分化的影响。结果:伴放线放线杆菌与干细胞按照1克隆:1细胞比例共培养后,细胞增殖明显增加;两者共培养后,干细胞CD44、CD166和骨桥蛋白均呈阳性表达,C-myc、Klf4、Runx2和Col1 mRNA表达明显增加,碱性磷酸酶活性仍较强。结论 :伴放线放线杆菌在体外促进人骨髓间充质干细胞增殖,增强干细胞干性,但却不影响干细胞的成骨分化潜能。

16S rDNA多重PCR检测牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和齿垢密螺旋体及混合感染与慢性牙周炎病变程度关系(英文)

目的 建立多重16S rDNA PCR方法用以同时检测慢性牙周炎(CP)临床标本中牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线放线杆菌(Aa)和齿垢密螺旋体(Td),并了解不同感染情况与慢性牙周炎严重程度的关系。方法 采集152例CP患者牙周袋标本,并按Hugoson的方法将其分为轻、中和重度三类,另采集30例牙周健康者龈沟标本作为正常对照。上述临床标本置于200μl裂解缓冲液中,100℃冰浴10min后取10μl上清液直接作为PCR的模板。采用常规酚-氯仿法提取Pg ATCC33277株、Aa Y4株、Td FM株和E.coli DH5α株的DNA分别作为PCR的阳性和阴性对照。采用Pg、Aa和Td 16S rDNA特异性引物,建立多重PCR检测上述标本。3例Pg、Aa和TdPCR结果均阳性患者牙周袋标本目的扩增片段T-A克隆后测序。采用X2检验分析Pg、Aa和/或Td感染率与牙周炎严重程度之间的关系。结果 所建立的多重16S rDNA PCR最低可检出10个Pg、20个Aa和20个Td细胞。Pg、Aa和Td 16S rDNA扩增片段测序结果与已报道的相应序列比较,相似性分别高达99.45％、97.08％和96.59％。30例牙周健康者龈沟标本中,仅有1例(3.3％)Pg、2例(6.7％)Aa的16S rDNA扩增结果阳性,其余标本均阴性。152例CP患者牙周袋标本中,147例(96。7％)检出Pg、Aa和/或Td的16S rDNA,5例(3.3％)扩增结果均阴性。

伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因的克隆

目的 探讨克隆伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因ltb_fap的方法。方法 采用PCR方法扩增伴放线放 线杆菌菌毛相关蛋白(Fap)和大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(Ltb)的融合蛋白基因ltb_fap,NcoⅠ EcoRⅠ双酶切 载体pET28a(+)及ltb_fap基因,连接形成重组质粒pETltb_fap,转化至大肠杆菌DH5α,扩增后提取质粒pETltb_fap进 行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果 本实验扩增的ltb基因约为303bp,fap基因约为228bp,融合基因约为 531bp。重组质粒含外源基因片段约为531bp,酶切鉴定可得到一条约531bp带,DNA测序结果表明与GenBank中 的fap基因序列有97.4%的同源性。结论 成功克隆出融合蛋白基因ltb_fap,为进一步进行蛋白表达、制备抗体奠 定基础。

抗伴放线放线杆菌IgY的制备及抑菌试验研究

目的:观察伴放线放线杆菌诱导母鸡产生特异性IgY抗体情况,以及其抑制伴放线放线杆菌(A.a)和牙龈二氧化碳噬纤维菌(C.g)生长效果。方法:应用免疫接种法、水稀释法、盐析法、液体培养抑菌法、以及ELISA法,诱导、提取和纯化IgY抗体,取一定量抗体与细菌共同培养,测定抑制伴放线放线杆菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌生长效果。结果:两步硫酸铵盐析沉淀的IgY抗体纯度达85.6%～90.3%;抗原结合效价为1∶32000;抗伴放线放线杆菌IgY抗体与牙龈二氧化碳噬纤维菌交叉免疫反应的抗原结合效价为1∶8000;当抗伴放线放线杆菌IgY抗体浓度在5.0、1.0、0.1g/L时,细菌浓度在5×108CFU/L培养24h其抑菌率分别为31.60%(P=0.004)、10.24%(P=0.024)、-3.30%,培养72h其抑菌率分别为64.20%(P=0.004)、53.21%(P=0.002)、11.20%。细菌浓度在1×108CFU/L培养24h其抑菌率分别为35.71%(P=0.004)、30.95%(P=0.012)、11.11%,培养72h其抑菌率分别为65.11%(P=0.005)、54.04%(P=0.002)、16.17%;5.0g/L的抗伴放线放线杆菌IgY与1×108CFU/L牙龈二氧化碳噬纤维菌培养24h其抑菌率为41.61%(P=0.005),培养72h抑菌率为86.99%(P=0.014)。结论:伴放线放线杆菌能够诱导母鸡产生高效价的特异性IgY抗体,该抗体在一定的浓度内有抑制伴放线放线杆菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌生长的作用;伴放线放线杆菌与牙龈二氧化碳噬纤维菌存在着共同抗原。

伴放线放线杆菌刺激淋巴细胞分化效应T细胞的研究

目的 :探讨Aa刺激淋巴细胞活化后效应T细胞的表达及意义。方法 :选取 10名全身及牙周组织健康受试者 ,抽取外周血 ,分离外周血单核细胞 (PBMC) ,体外刺激PBMC :实验组加入Aa冻干产物 (浓度为 2 5 μg/mL) ;阳性对照组加入刺激抗原PMA(2 5 μg/mL) +ionomycin(1μg/mL) ;阴性对照组不加任何刺激抗原。流式细胞仪检测T细胞内细胞因子IL - 2、IFN -γ、IL - 4、IL - 10的表达。结果 :Aa刺激淋巴细胞后上述四种细胞因子呈低水平表达 ;仅有 2 %左右的T细胞可分化出效应T细胞 ;Aa诱导IL - 4、IL - 10表达的能力相对较强。结论 :Aa刺激可造成T淋巴细胞免疫缺陷 ,导致IL - 2、IFN -γ等功能障碍 ,激发TH2细胞活性 ,进而使机体免疫功能严重受损 ,导致牙周组织的继发性损伤。

磷酸肌醇信号通路在磷脂酰胆碱阳性伴放线放线杆菌粘附和侵袭过程中的作用

目的:探讨磷酸肌醇信号通路在磷脂酰胆碱(PC)阳性伴放线放线杆菌(Aa)粘附和侵袭人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)过程中的作用。方法:采用磷酸肌醇信号通路中磷脂酶C(PLC)与G蛋白偶联受体结合过程的抑制剂U73122及其无活性的类似物U73343预处理HUVECs,分别通过粘附侵袭实验观察Aa对细胞粘附和侵袭能力;MTT法检测Aa对不同预处理细胞损伤情况;Ca^(2+)荧光探针检测Aa侵袭过程中细胞内Ca^(2+)的动员情况。结果:与对照组相比,U73122预处理细胞后,PC阳性Aa的侵袭率降低至(12.62±2.10)%、细胞存活率升高、抑制了Ca^(2+)的增加(P<0.05),粘附率则无显著差异(P>0.05);U73343预处理细胞后,PC阳性Aa的侵袭率、粘附率、细胞存活率与非预处理组相比无统计学差异(P>0.05);U73122拮抗了Aa引起的Ca^(2+)向HUVECs内聚集(P<0.05)。结论:磷酸肌醇信号通路中G蛋白偶联受体与PLC的结合在PC阳性Aa的粘附、侵袭细胞和诱导细胞死亡的过程中发挥了重要作用。

伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素序列进化分析

目的:应用生物信息学的方法研究伴放线放线杆菌(Aa)细胞致死性扩张毒素(CDT)的3个蛋白亚基在不同细菌中的序列变化情况,为牙周病中Aa菌株的检测提供思路。方法:运用ncbi genbank数据库、蛋白同源性比对(blast P和tblastn)及极大似然法构建进化树等,研究Aa中CDT蛋白的3个亚基在不同菌种的序列保守性。结果:在Genbank数据库674个属的细菌中,发现有20个属27个种含有CDT蛋白亚基,其中11个种的细菌只含有Cdt B蛋白亚基。在进化过程中,Cdt B与CDT其他两种亚基蛋白相比,序列间的变化无明显相关性,且蛋白序列更为保守。系统进化树分析表明,Aa的Cdt B蛋白与嗜血杆菌属、沙门氏菌属和螺杆菌属的细菌有较近的亲缘关系。结论:Aa CDT蛋白复合体的Cdt B与其他两个亚基的蛋白在序列进化上存在显著差异,推测一些菌种中CDT蛋白毒性功能的发挥并不需要3个亚基共同存在。

健脾护齿方对伴放线放线杆菌超声提取物作用下CD4^+CD25^+调节性T细胞免疫抑制功能的影响

目的:探讨健脾护齿方对伴放线放线杆菌(actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)超声提取物作用下CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory Tcells,Tregs)免疫抑制功能的影响。方法:免疫磁珠法分离正常BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+Tregs并进行体外培养,将300μg/mlAα超声提取物和不同剂量健脾护齿方药液加入培养液中,72h后收集细胞及上清液,Real-Time PCR法测定培养细胞Foxp3 mRNA的表达,ELISA法分别测定细胞上清液中IL-10,TGF-β水平。结果:Aa超声提取物能够显著上调CD4+CD25+Tregs Foxp3 mRNA的表达,增强其免疫抑制作用,但不影响CD4+CD25+Tregs分泌IL-10和TGF-β;健脾护齿方抑制Aa超声提取物上调CD4+CD25+Tregs Foxp3mRNA表达的作用,并且Foxp3 mRNA表达的抑制作用与健脾护齿方剂量之间呈剂量—效应关系。结论:健脾护齿方有抑制Aa超声提取物上调CD4+CD25+Tregs免疫抑制功能的作用,这种抑制效应可能与Foxp3基因表达的下调有关,并且不具有抑制性细胞因子依赖性。

伴放线放线杆菌全染色体DNA探针的制备和鉴定

本研究的目的是制备伴放线放线杆菌全染色DNA探针,并评价其特异性和敏感性。抽提标准菌株Aa Y4 DNA,经^(32)P标记后制成探针,然后用斑点杂交法鉴定探针性质。结果Aa全染色体DNA探针的灵敏性为8×10~2纯菌或1ng同源DNA,探针与口腔常见菌的杂交显示仅与嗜沫嗜血杆菌有较弱的交叉反应。提示^(32)P标记Aa全染色体DNA探针的敏感性、特异性均较高,且方便实用,有临床推广应用价值。

伴放线放线杆菌中幽门螺杆菌毒力相关基因的生物信息学分析

目的:应用生物信息学方法分析幽门螺杆菌(Hp)毒力岛基因和空泡毒素基因在伴放线放线杆菌(Aa)中的存在及序列的变化。方法:用ncbi genbank数据库、蛋白同源性比对(blastP和tblastn)、极大似然法构建进化树和计算序列多态性研究Aa中是否含有Hp的毒力岛基因及空泡毒素基因,分析其相应的序列变异特征。结果:在Aa菌株中含有4个Hp毒力岛基因的同源基因,cagE、cagX、cagY和cagBeta。与其他种属菌株相比,Aa的cagE与Hp有较近的亲缘关系,且Aa菌株含有cagE基因的比列较高;基因多态性分析发现,cagE在两个物种中均有较低的Tajima’s D值(负值),两者的Pi值存在明显差异(P<0.01)。结论:Aa中含有Hp的部分毒力岛基因,其中cagE在两个物种中有较近的亲缘关系,且受到了负向选择的作用。

伴放线放线杆菌形态变化对菌体表面疏水性影响的研究

目的研究伴放线放线杆菌形态变化对菌体表面疏水性的影响。方法采用碳氢化合物法检测伴放线放线杆菌粗糙型和光滑型的菌体表面疏水性,观察同一菌株不同表型疏水性的变化。结果伴放线放线杆菌粗糙型和光滑型菌体表面具有疏水性。14株粗糙型伴放线放线杆菌菌体表面疏水率高于4株光滑型,差异有统计学意义(P<0.05)。4株同源的粗糙型与其光滑型转变株比较得出除1株外,其余3株菌两种表型的菌体表面疏水率差异无统计学意义(P>0.05)。结论伴放线放线杆菌形态变化可引起菌体表面疏水性的改变,粗糙型转变为光滑型后菌体表面疏水性减弱。

免疫低下豚鼠伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌感染特征

目的 研究免疫低下对青少年牙周炎 (JP)特异性病原菌感染的影响。方法 二次6 0 Co全身照射制备免疫低下豚鼠及正常豚鼠各 36只 ,随机分组 ,下前牙龈沟接种伴放线放线杆菌 (Aa)和 或牙龈卟啉单胞菌 (Pg) ,于 2、3、6周分批处死 ,进行组织病理学及破骨细胞计数对比研究。结果 免疫低下Aa、Pg、Aa +Pg组 2、3周时牙周破坏明显 ,重于免疫正常组 ,破骨细胞计数高于免疫正常组 ,有统计学差异 (P <0 0 5 )。结论 免疫低下加重Aa、Pg对牙周组织破坏 ,机体免疫状态是JP发生发展的重要环节。

伴放线放线杆菌产生的细胞致死膨胀毒素及其与牙周病的关系

伴放线放线杆菌能产生一种热不稳定蛋白——细胞致死膨胀毒素。该毒素主要由三个相邻的基因编码,分别为cdtA,cdtB,cdtC,对应的蛋白产物分别是CDTA,CDTB,CDTC,它们构成三聚体的全毒素。它能引起细胞体积膨胀,使细胞停滞在G2/M周期而不能进入分裂期,通过线粒体途径导致淋巴细胞凋亡,诱导细胞因子的合成和分泌。由于该毒素具有多种细胞毒性,在牙周炎的发生发展中可能具有重要的致病作用。

伴放线放线杆菌诱导人外周血淋巴细胞活化及凋亡的体外研究

目的研究伴放线放线杆菌诱导人外周血淋巴细胞活化及凋亡的作用。方法选取10名全身及牙周组织健康受试者，分离外周血淋巴细胞，在有／无伴放线放线杆菌情况下培养0—96h，用荧光探针（AnnexinV—FITC、PI、CD69-TC7）进行标记，并进行流式细胞仪检测。结果全淋巴细胞加伴放线放线杆菌组AnnexinV＋／PI-细胞百分数在48h、72h、96h分别为13．42±2．88、22．74±2．18、46．92±4．28，全淋巴细胞组AnnexinV＋／PI-细胞百分数在48h、72h、96h分别为8．46±2．53、6．36±2．36、9．36±2．67，2组间存在明显差异（P〈0．01）。CD69加淋巴细胞加伴放线放线杆菌组和CD69＋淋巴细胞组AnnexinV＋／PI-细胞百分数除48h外的4个时间点上都无明显差异（P〉0．05）。CD69＋淋巴细胞加伴放线放线杆菌组AnnexinV＋／PI-细胞百分数在各个时间点上都明显高于全淋巴细胞加伴放线放线杆菌组（P〈0．01）。结论伴放线放线杆菌能够诱导人外周血淋巴细胞活化，并且能够通过活化促进其凋亡。