甲基化特异性PCR过程中的影响因素分析

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一。它是指在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基添加在DNA分子中的碱基上,常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶第五位碳原子和甲基闯的共价结合，即形成5甲基胞嘧啶（5mC），哺乳动物基因组中约70％的5mC存在于CpG二联核苷。DNA甲基化影响着基因的转录表达．因此它在基因的表达调控、细胞增殖、分化发育等方面起着重要作用，

东方蜜蜂微孢子虫N6-腺苷特异性甲基化转移酶基因的克隆、分子特性及表达模式

【目的】东方蜜蜂微孢子虫(Nosme ceranae)专性侵染成年蜜蜂导致微孢子虫病,给养蜂生产造成很大损失。目前,东方蜜蜂微孢子虫的N6-腺苷特异性甲基化转移酶(N6-adenine-specific methyltransferase,N6AMT)基因NcN6AMT的研究仍然缺失。本研究对NcN6AMT的编码序列(coding sequence,CDS)区进行克隆,并解析NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,进而测定东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)和中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂过程中NcN6AMT的相对表达量,以期丰富NcN6AMT的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子虫侵染过程NcN6AMT的功能及表观调控机制提供基础。【方法】采用Protparam和ProtScale软件对NcN6AMT进行等电点和亲水性分析。通过SignalP 5.0、NetPhos 3.1、TMHMM-2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等软件分别预测NcN6AMT的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域、二级结构和三级结构。使用WoLF PSORT II软件预测NcN6AMT的亚细胞定位。根据N6AMT氨基酸序列,通过TBtools软件对智人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis ATCC 50506)、蚱蜢脑炎微孢子虫(Encephalitozoon romaleae SJ-2008)、美洲思普雷格孢虫(Spraguea lophii 42_110)、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis CQ1)、隐生菱形藻(Nitzschia inconspicua)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的N6AMT进行结构域预测和分析。利用MEME软件和MEGA 11.0软件进行东方蜜蜂微孢子虫和其他物种N6AMT的保守基序预测及进化树构建。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂过程的相对表达量。【结果】通过PCR扩增出大小约500 bp的目的片段,克隆测序结果显示其与GenBank数据库收录的预测序列一致;NcN6AMT蛋白的分子量约为18.7 kDa,分子式为C845H1374N214O249S6,理论等电点为5.88,脂溶系数是119.76,不稳定系数为37.47,平均亲水系数为0.025,含166个氨基酸和15个磷酸化位点,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核和液泡膜;NcN6AMT含1个甲基转移酶小结构域(methyltransferase small domain,MTS),该结构域同样存在于家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫等8个其他物种的N6AMT;在东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT中均预测到5个相同的保守基序;NcN6AMT与家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT序列一致性达到70.92%;东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT在系统进化树上聚为一支;东方蜜蜂微孢子虫接种后1–4 d,NcN6AMT在意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂中肠内均呈现先上升后下降的表达趋势。【结论】成功克隆到NcN6AMT基因的CDS区,明确了NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,并揭示东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT蛋白具有较高的保守性,NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂的第一个增殖周期(1–4 dpi)内动态表达且均呈上升-下降的表达模式。

基于甲基化核酸内切酶的甲基转移酶活性的电化学检测研究

由DNA甲基转移酶(DNMT1)催化的DNA甲基化在许多生物过程中起重要作用,包括基因转录,基因组印记和细胞分化[1]。本文利用特异性酶切法成功开发了一种有效的测定DNMT1的电化学方法。首先,将硫醇修饰的双链DNA(dsDNA)自组装固定在金电极上,随后DNMT1识别dsDNA半甲基化序列并实现完全甲基化,最后通过甲基化特异性限制酶(BSSHⅡ)剪切,未发生完全甲基化的碱基序列将被剪切并移除电极表面。利用差分脉冲伏安法(DPV)分别测定剪切前后的亚甲基蓝(MB)还原电流。在最佳优化条件下,该方法线性范围为0.5 nM^50 nM,检测限为0.5 nM。这种方法可以简单有效地检测DNA甲基化和DNMT1活性,在DNA甲基化快速检测和基因毒理分析方面具有一定的实际意义。

子宫颈鳞状细胞癌组织中DNMT1 mRNA表达和E-cad甲基化检测

目的:探讨宫颈鳞状细胞癌组织中DNA甲基化转移酶(DNMT1)mRNA的表达和上皮钙粘附素(E-cadherin)的甲基化状况,分析其与宫颈鳞状细胞癌发生发展的关系。方法:应用原位杂交技术检测20例正常宫颈、60例CIN(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各20例)和40例宫颈鳞状细胞癌组织中DNMT1 mRNA的表达情况;利用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测E-cad基因启动子区甲基化状况,分析宫颈鳞状细胞癌中DNMT1 mRNA的表达与E-cad启动子区甲基化状况及2者之间的相关性。结果:DNMT1 mRNA在正常宫颈、CIN和宫颈鳞状细胞癌组织中表达逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05);DNMT1 mRNA在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ组织中表达的差异有统计学意义(P<0.05)。E-cad启动子甲基化率在正常宫颈、CIN、宫颈鳞状细胞癌组织中依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。E-cad启动子甲基化与DNMT1 mRNA的表达呈正相关(r=0.401,P<0.05)。结论:DNMT1 mRNA过表达和E-cad启动子异常甲基化与子宫颈鳞状细胞癌的发生发展关系密切;E-cad启动子甲基化过程可能是在DNMT1的催化作用下完成的。

脑胶质瘤O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动区甲基化及其表达异质性的研究

目的研究脑胶质瘤组织不同部位O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动区甲基化状态及其表达的差异性。方法在54例脑胶质瘤组织的中心和周边部位分别获取标本,共获得92份标本,采用巢式甲基化特异性PCR(MSP)进行MGMT启动区甲基化状态的检测,同时采用免疫组织化学方法进行MGMT蛋白表达的检测。结果 38例胶质瘤中获得了肿瘤两个不同部位MG-MT启动区甲基化的状态,其中24例胶质瘤MGMT启动区甲基化的状态是一致的,占总数的63.2%(24/38)。在29例胶质瘤患者中获得了肿瘤两个不同部位MGMT蛋白表达的情况,其中10例胶质瘤MGMT蛋白表达是一致的,占总数的34.5%(10/29)。两总体一致性概率间差值的95%置信区间为(5.6%和51.8%),两者的差异有统计学意义。巢式MSP和免疫组化都获得检测结果的标本有77份,在61份MGMT启动区甲基化标本中,25份MGMT蛋白表达阴性,14份蛋白表达可疑阳性,18份蛋白表达阳性,4份蛋白表达强阳性。在16份MGMT启动区非甲基化标本中,2份MGMT蛋白表达阴性,2份蛋白表达可疑阳性,9份蛋白表达阳性,3份蛋白表达强阳性,MGMT启动区甲基化状态与蛋白表达呈负相关(r=-0.318,P=0.005)。结论脑胶质瘤MGMT蛋白表达在同一肿瘤的不同部位存在明显的异质性。虽然脑胶质瘤MGMT启动区甲基化的状态在同一肿瘤的不同部位存在一定的异质性,但是大多数脑胶质瘤MGMT启动区甲基化的状态在同一肿瘤的不同部位是一致的。脑胶质瘤MGMT启动区甲基化状态的一致性优于蛋白表达的一致性。脑胶质瘤MGMT启动区甲基化,MGMT蛋白表达较少,MGMT启动区非甲基化,MGMT蛋白表达较多。

5-氮杂-2-脱氧胞苷对里氏木霉产纤维素酶的影响

为探究脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)甲基化修饰对丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei)产纤维素酶基因表达的表观遗传调控机制,利用不同浓度(0~1.0 mmol/L)的化学修饰剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5'-Aza)培养T.reesei QM9414.通过测定滤纸酶活性(filter paper enzymatic activities,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(carboxymethyl cellulose-Na enzymatic activities,CMCA)确定纤维素酶活性的变化;利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测0.1 mmol/L 5'-Aza培养的T.reesei QM9414中纤维素酶基因cbh1、egl1、酶激活因子xyr1基因以及分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的表达水平;通过甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)分析cre1、ace1、cbh1、egl1和xyr1基因上游序列的甲基化状态;利用Western blot和DNA甲基化定量测定分析了DNA甲基转移酶和DNA的甲基化水平.结果显示,0.1mmol/L 5'-Aza处理后的T.reesei QM9414菌株的FPA和CMCA最高,比出发菌株T.reesei QM9414分别高30%和53%;RT-q PCR结果显示,处理后的T.reesei QM9414菌株中纤维素酶基因cbh1、egl1与酶激活因子xyr1基因的相对表达量均高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1和ace1基因的相对表达量与出发菌株无明显差异;MS-PCR结果显示,cbh1、egl1和xyr1基因的非甲基化状态高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的非甲基化状态也无明显差异;Western blot和DNA甲基化定量测定结果分别显示,5'-Aza处理后菌株的DNA甲基转移酶表达比出发菌株明显降低,全基因组DNA甲基化程度也有下降.研究结果表明,5'-Aza处理T.reesei QM9414菌株后,纤维素酶活性明显增加,纤维素酶基因cbh1、egl1和激活因子xyr1基因表达水平的增加可能是通过DNA甲基转移酶影响DNA甲基化水平,最终调控基因的表达.

胃癌组织中BNIP3基因甲基化及其与DNMT1表达的关系

目的探讨人胃癌组织DNMT1表达及其与BNIP3基因甲基化状态的关系。方法收集120例手术切除并经病理学证实的胃癌组织及其相应的癌旁正常组织,采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测胃癌组织及其相应癌旁组织BNIP3基因甲基化状态,采用免疫组化SP法检测BNIP3基因及DNMT1基因的蛋白表达水平。结果 120例胃癌组织中有72例发生了BNIP3基因甲基化,甲基化阳性率为60.0%,其相应癌旁正常组织有5例发生了BNIP3甲基化,甲基化阳性率为4.2%,差异有统计学意义（χ~2=85.839,P〈0.01）,胃癌组织中BNIP3基因甲基化状态与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期无相关性（P〉0.05）,而与分化程度及淋巴结转移情况有相关性（P〈0.05）,胃癌组织中BNIP3蛋白的表达率为17.5%（21/120）,显著低于其癌旁正常组织（80.0%,96/120）,差异有统计学意义（χ~2=93.809,P〈0.01）,胃癌组织中DNMT1蛋白的表达率为75.0%（90/120）,显著高于其癌旁正常组织（5.8%,7/120）,差异有统计学意义（χ~2=119.195,P〈0.01）。胃癌组织中BNIP3蛋白与DNMT1蛋白的表达呈负相关（r=-0.542,P〈0.01）。结论 DNMT1高表达可能导致BNIP3蛋白表达减少,从而参与了胃癌的发生。

DNA甲基转移酶1与妇科恶性肿瘤

DNA甲基转移酶1（DNMTl）作为DNA甲基转移酶（DNMT）家族的主要成员，对维持和调节肿瘤细胞全基因组和局部区域甲基化起着核心作用。DNMTl在妇科恶性肿瘤中高表达，引起基因DNA的甲基化异常，特别是抑癌基因的高甲基化，继而造成相关基因表达沉默，导致细胞的恶性生长。

外周血单核细胞DNMT1及血清IL-6在糖尿病肾脏病中的表达及意义

目的 探讨外周血单核细胞DNA甲基化转移酶1(DNMT1)及血清白介素-6(IL-6)在糖尿病肾脏病(DKD)中的表达及临床意义。方法 选取150例DKD患者(DKD组)及50例同期健康体检者(对照组)。比较2组IL-6、DNMT1、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血肌酐、空腹血糖、肾小球滤过率估计值(e GFR)、24 h尿白蛋白排泄率(24 h UAER)的差异。Pearson相关分析IL-6、DNMT1与其他临床指标的相关性。多因素Logistic回归分析DKD发生的影响因素。受试者工作特征(ROC)曲线分析24 h UAER、IL-6、DNMT1及联合检测对DKD的诊断价值。结果 与对照组比较,DKD组的空腹血糖、IL-6、DNMT1、血肌酐、24 h UAER、LDL-C、糖化血红蛋白水平升高,而eGFR、HDL-C水平降低(均P<0.05)。DKD组的IL-6与DNMT1呈正相关(r=0.560,P<0.05);且IL-6、DNMT1与24 h UAER呈正相关(r分别为0.551和0.570,P<0.05)。24 h UAER、IL-6及DNMT1升高是影响DKD发生的独立危险因素(P<0.05)。24 h UAER、IL-6、DNMT1联合检测诊断DKD的曲线下面积优于单一指标检测。结论 DKD患者DNMT1、IL-6水平升高,24 h UAER、DNMT1、IL-6联合检测可作为临床诊断DKD的良好指标。

USP7和DNMT1在乙肝相关性肝癌中的表达及意义

目的 :研究泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin-specific proteinase, USP7)、DNA甲基化转移酶1(DNA methylation transferase 1, DNMT1)在慢性乙型病毒性肝炎(以下简称乙肝)相关性肝癌中的表达及临床意义。方法 :收集乙肝患者17例、乙肝肝硬化患者18例、乙肝相关性肝癌患者30例和健康体检者19例血清,采用ELISA法检测USP7、DNMT1、甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)的表达情况,并分析其临床意义。结果:肝癌患者血清AFP、USP7、DNMT1水平较健康体检者、乙肝及肝硬化患者高(P<0.05)。肝癌患者血清中USP7与肿瘤分期、Child-Pugh分级呈正相关(P<0.05),DNMT1与肿瘤分期、肿瘤个数呈正相关(P<0.05)。AFP、USP7、DNMT1均为乙肝相关性肝癌的影响因素(均P<0.05)。血清AFP、USP7、DNMT1水平均在肝细胞癌中有诊断效能(均P<0.05),且联合检测诊断效能高于单一检测。结论 :肝癌患者血清AFP、USP7、DNMT1水平较高,USP7、DNMT1与临床病理特征相关。三项指标联合测定能提高鉴别乙肝相关性肝癌的诊断效能。

DNMTl siRNA对人胰腺癌PaTu8988细胞周期的调控机制研究

目的研究沉默DNA甲基转移酶1(DNMTl)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和细胞周期的影响及可能机制。方法培养的人胰腺癌PaTu8988细胞分为空白对照组、阴性siRNA(15nmol/L)组、阴性siRNA(30nmol/L)组、DNMT1 siRNA(15nmol/L)组和DNMT1 siRNA(30nmol/L)组。转染48h后,采用real-time PCR和Western blotting评价沉默效率和细胞周期调控基因p21的表达情况;WST-8法检测细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果转染48h后,15nmol/L和30nmol/L浓度的DN-MT1 siRNA均明显抑制了DNMT1 mRNA和蛋白的表达;DNMT1 siRNA转染后人胰腺癌PaTu8988细胞增殖受抑制,各组细胞增殖抑制率依次为0%±12.0%、13.7%±8.2%、23.4%±7.3%、17.1%±5.8%和36.9%±14.2%,其中DNMT1 siRNA(30nmol/L)组的细胞增殖抑制率明显高于其他各组(P<0.01);DNMT1 siRNA(15nmol/L)组和DNMT1 siRNA(30nmol/L)组的G2/M期细胞百分率均显著低于其他各组,S期细胞百分率明显高于其他各组(P<0.05);DNMT1 siRNA(30nmol/L)组细胞周期调控基因p21 mRNA相对表达量明显高于其他各组(P<0.01)。结论DNMTl siRNA能特异性抑制胰腺癌细胞DNMTl的表达,并抑制细胞增殖、促使细胞出现S期阻滞,其机制可能与上调细胞周期调控基因p21的表达有关。

DNA甲基化起始的原动力:sidRNAs

DNA胞嘧啶甲基化（5m C）是一种重要的表观遗传修饰,它对于调控基因表达,沉默转座子和维持基因组的稳定等具有重要作用.相对于动物中DNA的甲基化主要以CG形式存在,植物中DNA的甲基化有3种类型：CG,CHG和CHH（H代表A,T或C）甲基化.

地西他滨治疗成人急性髓系白血病的应用价值探讨

目的探究分析地西他滨治疗成人急性髓系白血病的应用价值。方法本研究回顾性分析2015年1月至2017年12月在盐城市第一人民医院接受治疗的60例成人急性髓系白血病患者,其中将施行常规化疗方案的30例患者列为对照组,施行地西他滨药物化疗方案的30例患者列为试验组,分析评估其应用效果。结果试验组患者的有效率为96.67%,明显高于对照组的80.00%;试验组患者的不良反应发生率13.33%,明显低于对照组的36.67%;试验组患者的血红蛋白、血小板及白细胞治疗后较对照组均更高;生存率比较中,试验组86.67%高于对照组的63.33%,以上组间对比,差异均有统计学意义,P<0.05。结论采用地西他滨治疗成人急性髓系白血病的疗效显著,但在治疗过程中需注意对患者不良反应的防范,以改善预后。

LSD1、MGMT和Ki-67在高级别胶质瘤中的表达及对预后的影响

目的 探讨组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)、O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)、细胞增殖相关抗原Ki-67在高级别胶质瘤中的表达及其对预后的影响.方法 选取新疆医科大学第一附属医院2011年1月至2017年6月经病理证实的Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤标本65例,采用免疫组织化学(SP法)检测病理标本中LSD1、MGMT和Ki-67蛋白的表达情况,通过长期随访评价治疗效果,分析3种标志物与患者病理分级、无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)的关系.结果 65例高级别胶质瘤标本中,LSD1、MGMT、Ki-67总体阳性表达率分别为70.8% (46/65)、60.0%(39/65)、100%(65/65).LSD1和MGMT在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中的表达差异无统计学意义(x2=1.588,P=0.208;x2=0.013,P=0.908).Ⅳ级胶质瘤中Ki-67表达(+)、(++)、(+++)分别为18、19、11例,Ⅲ级胶质瘤中Ki-67表达(+)、(++)、(+++)分别为11、5、1例,两者表达强度差异有统计学意义(Z=-2.083,P=0.037).log-rank检验表明,LSD1、MGMT的阳性表达及Ki-67不同程度的阳性表达均与高级别胶质瘤患者PFS呈负相关(x2=12.217,P=0.007;x2 =4.446,P=0.035;x2=12.536,P=0.002),也与OS呈负相关(x2=11.708,P=0.008;x2=6.637,P=0.010;x2=11.807,P=0.003).病理分级为Ⅳ级的患者较Ⅲ级患者更容易出现疾病局部进展(x2=6.573,P=0.010),且OS短(x2=3.974,P=0.046).Cox比例风险模型分析结果提示,LSD1表达(HR=1.361,95%CI为1.094~1.694,P=0.006;HR=1.406,95% CI为1.117~1.771,P=0.004)和Ki-67表达(HR=1.703,95%CI为1.175~2.468,P=0.005;HR=1.778,95%CI为1.209 ~2.616,P=0.003)是高级别胶质瘤患者PFS和OS的独立预后风险因子.相关分析结果显示,MGMT与LSD1的表达呈正相关(r=0.406,P=0.001).结论 LSD1、MGMT、Ki-67在高级别胶质瘤中总体阳性表达率较高,MGMT为高级别胶质瘤预后相关因素,LSD1、Ki-67可作为高级别胶质瘤预后的独立预测指标.

As3MT、N6AMT1基因-环境交互作用对砷暴露所致皮肤损伤影响

目的探讨砷甲基转移酶(As3MT)和N-6-腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1(N6AMT1)基因多态性及基因-环境交互作用与砷暴露所致皮肤损伤(AISL)的关联性。方法于2010年9月到2011年12月在内蒙古五原县入选饮水型砷暴露人群335人,65例被确诊患有AISL。应用MassARRAY^(?)分子量阵列平台检测基因型,高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定尿砷代谢物,砷暴露时间由其高砷水饮用时间确定,多因子降维法与岭回归模型分析基因型、环境因素的单独效应及基因-环境的交互作用。结果 As3MT基因rs3740400位点CA/AA基因型、N6AMT1基因rs 1006903位点GC/CC基因型和尿二甲基胂酸(DMA)升高为AISL的独立危险因素(P<0.05)。rs3740400位点基因型-尿无机砷(iAs)-单甲基胂酸(MMA)的交互作用与AISL发生风险间存在显著的统计学关联(OR=0.62, 95%CI=0.41～0.94,P=0.024),模型的验证样本准确率为0.577 6,交叉验证一致性为9/10。结论 As3MT、N6AMT1基因多态性及尿砷化合物水平均与AISL独立相关,rs3740400位点基因型、尿iAs和MMA的交互作用在慢性砷中毒的发生发展中具有重要作用。