基于微滴式数字聚合酶链式反应检测EGFR基因Ex19del和L858R突变方法的优化

目的为采用微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)技术建立并优化检测EGFR基因敏感突变[19外显子缺失(Ez19del)和21外显子L858R突变(L858R)]的方法。方法应用新型位点一参考探针法检测Er19del突变,采用传统野生-突变探针法进行L858R突变检测分析。应用温度梯度法优化2种突变检测方法的退火温度,并分析其特异度和灵敏度等。结果实现Ea19del突变多重位点缺失一次性检测,确定最佳退火温度为60.1℃,所建立方法具有良好的特异度,灵敏度分析显示突变检测下限为0.5%;L858R突变检测方法退火温度设定为58.2℃,特异度良好,通过灵敏度检测确定检测下限为0.1%。结论应用ddPCR成功建立并优化EGFR基因E19del和L858R敏感性突变的检测方法,为ddPCR的临床应用提供更多参考与支持。

基于微滴式数字PCR的KRAS基因外显子2密码子12/13突变检测方法的建立

目的 应用微滴式数字PCR技术(ddPCR)建立鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)外显子2密码子12/13多种突变类型一次性检测。方法 采用位点-参考探针法设计探针及引物,建立KRAS基因外显子2密码子12/13多位点突变反应体系,优化反应条件及退火温度,分析所建立方法的灵敏度和特异度,并进行实例验证。结果 成功建立KRAS基因多位点突变一次性检测的方法,并确立最佳退火温度为63℃。该方法特异度良好,灵敏度分析示最低检测限为0.5%,实例验证可应用于组织样本检测。结论 成功建立基于ddPCR技术KRAS基因外显子2密码子12/13突变检测方法,实现多位点突变一次性检测,其中仅需两类探针和一对PCR引物。