富集低丰度蛋白的人类精子全蛋白二维电泳整合图的建立

目的:运用二维电泳(2-DE)技术分离人类正常精子低丰度蛋白并建立全精子蛋白的2-DE整合图。方法:30例精子标本混匀后一次性进行蛋白提取,分别使用0.8、0.6、0.5、0.3 mg的蛋白上样量进行2-DE。运用MALD I-TOF法对确定2个恒定蛋白点的等位点(PI)和相对分子质量(Mr)作为图像的内参照点,对不同上样量的2-DE图进行比较分析,最后合成1张富集低丰度蛋白的整合图。结果:在0.5 mg图中分离出(1 080±23)个蛋白点,并合成具889个匹配点的整合图A。在上样量为0.8、0.6及0.3 mg的2-DE图中,分别新检测到381、50、32个在0.5 mg图中未检测到的蛋白点。最后合成具1 352个蛋白点的整合图B。结论:通过改变上样量的方法促进低丰度蛋白分离并合成具1 352个蛋白点富集低丰度蛋白的2-DE整合图。

斑节对虾血淋巴低丰度蛋白双向电泳技术体系的优化

文章探索并优化了斑节对虾（Penaeus monodon）血淋巴双向电泳技术体系，对斑节对虾血淋巴总蛋白抽提方法进行优化，减小高丰度蛋白的影响；对双向电泳过程各步骤，如IPG胶条pH范围的选择、等电聚焦程序、上样量等进行了优化，得到高分辨率的2-DE图谱，用PDQuest软件进行了初步分析。结果表明，用PEG 6000能更快捷有效地去除血淋巴中的高丰度蛋白，增加低丰度蛋白的点数及浓度；在抽提蛋白过程中，利用预冷的80%丙酮洗涤，在一向电泳过程中设置100 V低压除盐，能更有效地去除蛋白中的盐分；采用18 cm、pH 3~10 NL 的中型胶条，能更好地显示低丰度蛋白点的分布；被动水化上样300 μg结合硝酸银染色方法，能有效提高双向电泳图谱中蛋白点的分离度和分辨率。该试验为斑节对虾及其他甲壳动物血淋巴蛋白质组学相关研究提供了稳定可重复的研究方法。

固相配体文库降低血清高低丰度蛋白浓度差异

目的探讨固相配体文库技术富集血清低丰度蛋白及提高质谱鉴定低丰度蛋白敏感性。方法3组混合血清标本采用蛋白富集珠(ProteoMiner)处理,一维或二维电泳图谱分析比较处理前后血清图谱中的差异条带或蛋白质斑点,并于处理后血清的二维电泳图谱中显著增加的蛋白质斑点进行高效液相色谱法电喷雾串联质谱鉴定。结果一维及二维电泳图谱表明,固相配体文库技术能显示更多的蛋白条带或蛋白质斑点;显著富集的蛋白质点进行质谱鉴定结果表明,固相配体文库技术能够提高血清低丰度蛋白质谱鉴定,如簇集蛋白、玻连蛋白、C4b结合蛋白α链、补体C4-A等。结论固相配体文库技术能有效地富集血清中低丰度蛋白,同时稀释高丰度蛋白,表明该技术有助于血清中低丰度蛋白的分离、富集与鉴定。

利用肽配体库分析蛋清中低丰度蛋白质组

利用肽配体库技术(CPLL)研究了蛋清中的低丰度蛋白质组。考察了盐浓度和洗脱顺序差异对CPLL富集效率的影响。结果表明:盐浓度越高,蛋清蛋白质溶液的离子相互作用越强。利用洗脱溶液解离差异,采用先HOS(有机水溶液)后尿素CHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)的洗脱顺序,溶菌酶能够得到高效分离。保持蛋清的原p H 8.8,25 mmol/L KH2PO4,150 mmol/L Na Cl,尿素CHAPS洗脱,是CPLL提供高效富集的前提。通过分析CPLL富集前后的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)条带差异,采用线性离子阱(LTQ)质谱在蛋清中检出45种低丰度蛋白质,其中两种未见报道。对蛋清中低丰度蛋白质亚细胞的定位分析发现,蛋清蛋白质的分泌蛋白居多。研究结果表明,CPLL技术能够实现蛋清中低丰度蛋白质的高效富集,分析深度达到亚细胞水平。

肽文库富集荷斯坦奶牛血浆和血清中低丰度蛋白的效果研究

【目的】获取牛血浆和血清蛋白质组中低丰度蛋白的表达信息。【方法】采用肽文库试剂盒ProteoMiner富集荷斯坦奶牛的血浆和血清,运用二维凝胶电泳结合液相色谱串联质谱方法,分析富集前后血浆和血清中蛋白的变化。【结果】牛血浆和血清经ProteoMiner试剂盒富集,白蛋白含量显著下调(血浆和血清的差异显著水平分别为P=0.02和P=0.01),载脂蛋白E显著增加(血浆和血清的差异显著水平分别为P=0.02和P=0.01)。【结论】该法在降低牛血浆和血清中高丰度蛋白的同时有效富集了低丰度蛋白,有利于血浆和血清中低丰度蛋白质组的研究。

低丰度蛋白Mlo的免疫金标记技术研究

小麦Mlo蛋白是一种低丰度蛋白。本文利用Mlo蛋白的2种抗血清对不同标记条件下的免疫胶体金标记情况进行了研究。结果表明,一抗结合时间对标记结果有影响,60 min的标记时间对Mlo蛋白定位比较合适;小麦Mlo蛋白IL2抗血清对Mlo蛋白的标记效果要比CT抗血清的标记效果好;IgG胶体金探针要比蛋白A胶体金探针更适合于对低丰度蛋白的检测。

RCA技术联合免疫反应检测低丰度蛋白质的研究

目的:建立一种检测微量蛋白质的滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)。方法:以血管内皮生长因子为研究对象,利用链亲和素做桥接,将免疫反应和RCA技术进行有效的结合,构建一种新型的蛋白质检测方法。结果:通过优化实验条件,对血管内皮生长因子检测的灵敏度达到10fM,大大超过传统的ELISA方法。结论:RCA技术联合免疫反应能够高特异性、高灵敏度地检测低丰度蛋白质,具有广阔的临床应用前景。

一种有效检测水稻叶鞘低丰度蛋白的方法

蛋白质组学研究中,低丰度蛋白的富集、检测和鉴定是主要的技术难题。植物组织中核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(rubisco)等高丰度蛋白占细胞全蛋白很大比例,严重影响双向凝胶电泳(2-DE)对低丰度蛋白的检测。为探索一种适用于叶鞘低丰度蛋白的有效检测方法,本研究采用聚乙二醇(PEG)沉淀法以减少rubisco等高丰度蛋白,富集低丰度蛋白。以Mg/NP-40法为对照,分别使用15%和20%PEG分离水稻叶鞘可溶性全蛋白,并将对照和各PEG分离组分进行2-DE。2-DE图谱经软件分析结果表明,20%PEG沉淀法适用于灌浆期叶鞘低丰度蛋白检测。

PEG分级法检测绿竹叶片双向电泳中的低丰度蛋白

蛋白质组学研究的关键问题之一是双向电泳(2-DE)中低丰度蛋白的分析,主要是因为相关高丰度蛋白的存在,导致IPG胶条无法吸胀低丰度蛋白,使得低丰度蛋白在2-DE中很难被检测出来。利用梯度浓度的PEG4000沉淀方法来富集绿竹叶片中不同丰度的蛋白质,从而使得低丰度蛋白在凝胶中显现出来。在PEG分级法和传统的全蛋白提取法的2-DE比较中,发现采用PEG分级沉淀法提取的蛋白质的数量以及类别明显增加,高丰度蛋白主要富集在8%和16%的PEG浓度组分中,使得其他组分中的低丰度蛋白与高丰度蛋白组分分别进行2-DE分析。经过对图像和数据的比较、分析,PEG分级法得到的5个组分蛋白点总数超过了1032个,大约是传统蛋白提取方法制备蛋白样品的3倍。

Western blotting中低丰度蛋白转膜方法改进

目的:改进Western blotting转膜方法,提高低丰度蛋白转膜效率。方法:在Western blotting转膜过程中,采用不同孔径的PVDF膜、不同的转膜时间及不同的甲醇含量进行转膜。转膜后,考马斯亮蓝染色观察PAGE胶上蛋白残留情况,ECL发光法检测FGFR1曝光强度。结果:通过改变膜孔径大小和转膜时间所得实验结果可见,孔径为0.22μm的PVDF膜转移2h的转膜效率更高。通过改变转膜液中甲醇含量所得实验结果可见,甲醇含量为10%转膜效率更高。结论:本实验对Western blotting转膜过程中低丰度蛋白的转膜方法进行了成功改进,改进后能提高蛋白显影强度,具有广泛的应用前景,是一种方便可行的操作方法。

肿瘤微环境的旁分泌型低丰度蛋白组检测的新液质联用方法

目的建立一种新液质联用方法检测肿瘤微环境中旁分泌型低丰度蛋白。方法用丙酮提取C57/B6小鼠皮下脂肪原代细胞培养基中的蛋白质,通过四维⁃高场非对称波形离子迁移谱⁃静电场轨道阱线性离子阱模式(4D⁃Faims⁃OTIT),电子转移裂解⁃静电场轨道阱线性离子阱模式(ETD⁃OTIT)和静电场轨道阱线性离子阱模式(OTIT)三种液质联用模式分析。结果S1样本4D⁃Faims⁃OTIT,OTIT和ETD的蛋白鉴定数分别为1040±21,428±4和274±6,S2样本分别为851±31,290±10和192±14。S1中修饰位点分别为138±12,105±1和75±14,S2中分别为122±15,66±15和42±7。4D⁃Faims⁃OTIT在S1中鉴定到分泌型蛋白为结肠癌(GDF15)、肺癌(CXCL12)、胰腺癌(Cathepsin D/B)、卵巢癌(Insulin⁃like growth factor)、肝癌(Apolipoprotein E/Cystatin C)。结论4D⁃Faims⁃OTIT可显著提高肿瘤微环境中脂肪细胞分泌型蛋白组的检测灵敏度,有助于结直肠癌、肺癌和卵巢癌等疾病机理的研究。

大豆低丰度蛋白提取物对小鼠免疫功能及抗氧化能力的影响

为研究大豆低丰度蛋白提取物对小鼠免疫功能及抗氧化能力的影响,选用21日龄断奶ICR雄性仔鼠180只,随机分为5组,每组36只,试验期28d,每天灌胃大豆低丰度蛋白提取物200μL(以提取物中蛋白含量计,分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0mg)。结果表明:1)试验第7天时,处理组小鼠的白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数目均高于对照,且D_(4.0mg)组极显著高于对照(P<0.01)。2)试验第7和28天时,D_(4.0mg)组小鼠的脾脏指数均高于其他试验组;第7天的处理组小鼠脾脏IL-2、TNF-α基因的相对表达量均高于对照。3)第7天的D_(4.0mg)组小鼠血清T-AOC活力低于其他试验组,第28天的处理组均高于对照;第28天的D_(4.0mg)组小鼠肝脏SOD和GPX基因相对表达量均低于其他试验组。研究发现灌胃大豆低丰度蛋白提取物导致试验初期的小鼠发生了过敏反应,尤以D_(4.0mg)组小鼠最明显;试验后期,小鼠的过敏反应得到缓解甚至消失,抗氧化能力得到一定提高。

蛋白质组研究中低丰度蛋白质的富集与鉴定技术

随着分离技术、质谱设备与生物信息学的发展,对复杂蛋白质组的深度覆盖研究已不再是遥不可及,对8 000个基因产物的规模化鉴定已经趋于常规化。然而,更深一步的蛋白质组覆盖,就遇到了低丰度蛋白质分离、鉴定等更高的挑战。因此,针对低丰度蛋白质鉴定方法与相关分离分析技术的发展,本文综述了改善低丰度蛋白质鉴定效率的三种方法的最新进展,包括蛋白质的高分辨分离与质谱分析策略、低丰度蛋白质的选择性富集方法和高丰度蛋白质的消减策略等。针对生物体系蛋白质组成的深度鉴定研究,逐步用于探索生命体在不同条件下蛋白质组的表达与修饰的动态变化,并最终发现具备重要生理与病理功能的调控性蛋白质、寻找候选药物靶标。

低温脱脂大豆粕的低丰度蛋白提取和高丰度蛋白去除条件的优化（英文）

目的:优化低温脱脂大豆粕中的低丰度蛋白提取和高丰度蛋白去除条件,为进一步探讨大豆低丰度蛋白对动物的生理功能影响提供试验材料。创新点:结合提取时间和异丙醇浓度,将超声波(超声时间、功率)用于辅助异丙醇去除大豆高丰度蛋白和富集低丰度蛋白的研究。方法:在单因素试验基础上,设计了超声时间、超声功率、提取时间和异丙醇浓度等四因素三水平的正交试验。并通过测定提取液中的蛋白浓度和通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、质谱分析(MS)等蛋白质组学手段鉴定提取液或丙酮沉淀物中的蛋白质含量,实现了大豆高丰度蛋白去除和低丰度蛋白提取条件的优化。结论:50%异丙醇,350 W超声15 min,提取1 h是大豆低丰度蛋白提取的最佳条件。提取物含多种低丰度蛋白(油质蛋白、大豆未知蛋白、磷酸酯D和无特征大豆蛋白),且无大豆高丰度蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)。

甲醇沉淀法去除人血清高丰度蛋白质的实验研究

目的常用人血清高丰度蛋白质(high abundant proteins,HAP)去除方法操作较繁且成本高,文中探索建立简便有效的甲醇沉淀法去除人血清HAP。方法用不同体积的甲醇处理血清样品,然后与原血清样品上样进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,并对去除HAP后的样品进行蛋白定量检测。结果 SDS-PAGE显示,经甲醇处理过的血清样品与原血清电泳结果相比,相对分子质量在50 000～80 000间的清蛋白等HAP被明显去除,血清清蛋白平均浓度显著降低,由(47.65±0.35)g/L下降至(1.16±0.08)g/L,去除率达97%以上,占血清总蛋白质比例由65.4%下降为49.3%,其差异具有统计学意义(P<0.01)。同时一些被HAP掩盖的低丰度蛋白质(low abundant proteins,LAP)有所显现和保留。结论甲醇沉淀法可简便有效地去除人血清中清蛋白等HAP,为进一步行血清蛋白质组学分析奠定基础。

离心超滤法去除血清大相对分子质量高丰度蛋白质的实验研究

目的建立离心超滤法去除血清中大相对分子质量高丰度蛋白质的实验方法,研究其去除效果及重复性。方法取血清与20%乙腈按1∶4(V/V)混合,将混合后的血清分别加入相对分子质量分离点(MWCO)为100×103、50×103、30×103及10×103超滤膜离心管中,离心15min(8000×g)。滤液真空冷冻干燥后,以超纯水按浓缩10倍复溶。分别应用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法和二元梯度高效液相色谱法(HPLC)分析比较血清中大相对分子质量高丰度蛋白质去除效果,考察经50×103超滤膜离心去除血清中大相对分子质量高丰度蛋白质后保留低丰度蛋白质的重复性。结果以选择MWCO为50×103和30×103较为适宜。电泳分离结果显示,经离心超滤后滤过液中大相对分子质量高丰度蛋白质,特别是清蛋白得到有效去除。HPLC检测结果显示,选用MWCO为50×103超滤膜分离后,血清低丰度蛋白质数量保留适中。重复性统计结果显示,小相对分子质量低丰度蛋白质相对保留时间和相对峰面积RSD值分别小于0.46%和5.56%。结论离心超滤法去除血清中大相对分子质量高丰度蛋白质步骤较为简便、重复性好,为进一步深入研究血清蛋白质组学奠定了基础。

两种方法去除肺癌患者血清高丰度蛋白的研究

目的:去除肺癌血清中的高丰度蛋白,为寻找肺癌早期肿瘤标志物奠定基础。方法:血清经除脂后按血清:水:乙腈=1:2:4.5(v/v/v)沉淀分离高丰度蛋白,用SDS-PAGE验证去除效果。试剂盒去除血清高丰度蛋白,对体检健康者和非小细胞肺癌患者去除高丰度蛋白前后的血清凝胶电泳图像进行分析。结果:经本法去除后血清蛋白含量呈显著降低。与等量上样原血清电泳结果相比,相对分子量在50-80k D间的蛋白质被明显去除,而被其掩盖的相对分子质量在10k D以下的低丰度蛋白质得以显现。结论:乙腈沉淀法提供了一种经济、简便、重复性较好的人血清高丰度蛋白去除方法,为进一步寻找肺癌早期肿瘤标志物奠定了基础并提供了技术支持。

富含高丰度蛋白的人参果实双向电泳图谱的建立

通过常规的TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法对人参果实蛋白的提取效果,确立了丙酮沉淀法更适合人参果实蛋白的提取.为进一步改善其2-DE分离效果,对丙酮沉淀法提取的总蛋白用Tris-饱和酚提纯,在其2-DE图谱效果有所改善的基础上,又在Tris-饱和酚中加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)对丙酮沉淀法提取的总蛋白进行再次提纯,最终得到质量较高的2-DE图谱,其高、低丰度蛋白都得到了较好的分离.

血清蛋白质组学研究中乙腈沉淀法去除清蛋白的实验研究

目的建立去除人血清清蛋白的乙腈沉淀法并研究其去除效果。方法血清经除脂后按血清:水:乙腈=1:2:4.5(v/v/v)比例沉淀分离高丰度清蛋白,用SDS-PAGE验证去除效果和重复性。分别对4名体检健康者和非小细胞肺癌患者去除清蛋白前后的血清凝胶电泳图像进行分析。结果经本法去除后血清清蛋白平均浓度由(50.65±2.82)g/L下降为(2.50±0.71)g/L,占血清总蛋白比例由65.1%下降为33.3%,呈显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。与等量上样原血清电泳结果相比,相对分子量(Mr)在50000～80000间的蛋白质被明显去除,而被其掩盖的低丰度蛋白质得以显现,蛋白质条带明显变窄。结论乙腈沉淀法提供了一种经济、简便,且重复性较好的人血清清蛋白去除方法,为血清蛋白质组学研究提供了技术支持。