3种碱性染液对显微捕获联合低体积扩增技术的影响

目的:比较3种碱性染液对显微捕获联合低体积扩增(Lowvolume polymerase chain reaction,LVPCR)技术的影响,为细胞分离检验中细胞核标记物的选择提供依据。方法:显微捕获联合LVPCR中,用苏木素、龙胆紫、亚甲基蓝3种染液对口腔上皮细胞进行标识。参照龙胆紫染色法,比较0.5、1、2、5、8μl苏木素染液及2、5、8、10、15μl亚甲基蓝染液的染色效果,优化染色条件;并比较优化后的细胞核标识效果。显微操作仪捕获3种染液染色后的细胞进行DNA检验,比较检测结果;并捕获染色10、30、60 min口腔上皮细胞,比较染色时间对DNA检测结果的影响。结果:100μl口腔上皮细胞悬液加入2μl苏木素、0.5μl龙胆紫或5μl亚甲基蓝染液,细胞核均着色明显,与胞浆对比清晰。5个细胞的分离检验结果示有效分型率分别为90%、100%、66.7%,成功分型率为20%、100%、11.1%;龙胆紫、苏木素染色时间(≤60 min)对DNA检测结果无明显影响,而亚甲基蓝染色时间延长导致等位基因丢失等现象加重,影响检测结果。结论:3种染液均可清晰标识细胞核;而龙胆紫染液对LVPCR技术抑制最弱,为三者中较优的细胞核标记物。

显微捕获技术结合低体积扩增技术在混合唾液斑检验中的应用

显微捕获技术联合应用低体积扩增技术,建立一种分离混合唾液斑的口腔上皮细胞,并获得DNA分型的方法。方法:制备模拟混合唾液斑,利用显微操作捕获细胞技术捕获口腔上皮细胞,将捕获的细胞直接放置到安利快得玻片反应位点上,加PK孵育,然后加入PCR反应混合物进行反应。结果:利用该方法捕获一个口腔上皮细胞12次,可以成功分离模拟混合唾液斑中的两名供者的DNA分型。得出显微捕获技术联合应用低体积扩增技术对混合唾液斑类检材有重要意义的结论。

激光捕获显微切割结合低体积扩增技术研究

目的:研究激光捕获显微切割技术联合应用低体积扩增技术,建立一套微量混合样本DNA的检验方法。方法:使用PALM系统切割捕获目标细胞,弹射到低体积扩增玻片的反应位点上,消化细胞,提取DNA,使用Identifiler?试剂盒在1.5μL体系中进行PCR扩增。结果:分别捕获10个口腔上皮细胞、20个精子细胞,成功获得16个完整的STR基因座分型谱带。结论:激光捕获显微切割技术联合应用低体积扩增技术适用于法医学中微量混合样本DNA检验。

PALM结合低体积扩增技术在混合斑检验中的应用

目的PALM系统联合应用低体积扩增技术,建立一种提取混合斑中精子DNA的分型方法。方法利用PALM切割捕获理想检材的精子细胞,将捕获的细胞直接放置到低体积扩增玻片的反应位点上,裂解细胞之后进行PCR扩增。结果20个精子细胞8次分型中,7次分型结果完全正确。10个精子细胞8次分型中,4次分型结果完全正确。1个精子细胞8次分型中,出现位点的基因座均在10个以上。将该方法应用于两例实际案例的混合斑检材,取得了满意效果。结论联合运用PALM系统和低体积扩增技术对混合斑检材中的精子细胞检验具有重要意义。

激光显微切割技术与低体系扩增方法的法医学应用探索

目的建立减少DNA低体积扩增过程中产生气泡的方法。方法采用激光显微切割技术、PALM系统收集目标细胞,并在1μL～1.5μL低体积扩增样本,加入扩增液0.7μL～0.8μL。结果低体积扩增反应中的失败位点比例为2.3%,比常规反应位点时常会产生气泡导致该位点样本扩增失败且达30%以上的比例显著降低。结论低体积扩增方法可以减少或克服扩增过程中气泡的产生,提高扩增成功率。

龙胆紫染色法在显微捕获单细胞分离技术中的应用

目的建立用于显微捕获单细胞技术的龙胆紫染色法并评价其应用效果。方法制作20枚口腔拭子脱落细胞悬液,配制0.05g/mL龙胆紫染液。取100μL口腔细胞悬液加入0.15、0.25、0.5、1.0、2.0μL染色液,考察最佳染色浓度;分别染色5、10、30、60min,考察最佳染色时间;用最佳条件染色后抓捕3个细胞,采用联合LV-PCR技术扩增并进行DNA分型检测,进行重复试验20次,并对同一检材未经染色的抓捕细胞进行检测,用于比对STR分型成功率。将龙胆紫染色法用于案例检材的口腔上皮细胞分离检验。结果 100μL细胞悬液加入0.5μL 0.05g/mL龙胆紫染液,染色5min,胞核呈紫红色,与胞浆对比明显;染色时间延长不影响染色效果及细胞分离检验结果。优化后的龙胆紫染色法对低体积扩增无明显抑制(P>0.05)。应用此染色法于案例检材,胞核标识清晰,STR分型结果达同一认定标准。结论龙胆紫染色法利于细胞核的发现,有助于提高显微捕获单细胞技术的检测效能。