纤维蛋白肽与低分子量尿激酶原融合蛋白的构建及性质

将人工合成的寡核苷酸片段进行定向连接后 ,得到编码纤维蛋白 β链N端 (β 15～ 42 )多肽的基因片段及连接区片段 (linker) ,再与低分子量尿激酶原 (scuPA 32k)cDNA分子进一步连接后 ,得到了Fβ (15～ 42 ) /scuPA 32k的融合基因 .在大肠杆菌中经过IPTG诱导表达 ,经过变性及复性 ,Zn2 + 螯合层析及SephacrylS2 0 0凝胶层析后 ,目的蛋白被纯化 .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示为一条蛋白质纯化条带 ,分子质量为35ku .经纤维蛋白平板法测定比活为 870 0 0U/mg.经纤溶酶活化后的融合蛋白与低分子量尿激酶相比 ,对显色底物S2 44 4酶促动力学性质相似 .同时Fβ (15～ 42 ) /scuPA

凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体(DscuPA-32K)中的应用

将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体 (DscuPA 32K)基因 ,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA 32K分子较大并且表达量较高 ,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质 ,为了获得有活性的蛋白质 ,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法 ,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较 ,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法 ,具有成本低 ,效率高 ,并对目的蛋白质 (DscuPA 32K)进行了初步纯化等优点 ,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时 。

真核低分子量尿激酶原突变体基因在大肠杆菌中的高效表达

通过一种融合抗栓肽的低分子量尿激酶原的突变体 (DscuPA 32K)在大肠杆菌中表达的研究 ,进行了一系列不同条件下的实验 .DscuPA 32K在菌株BL2 1中的表达很低 ,表达量仅为 3% ;为提高其表达量 ,引进一种整合稀有tRNA基因的菌株BL2 1 CodonPlusTM RIL ,增加大肠杆菌中识别稀有密码子的tRNA的数量 ,DscuPA 32K的表达水平确实有了很大提高 ,最大表达量约占 2 0 % .结果表明 ,富含稀有密码子的DscuPA 32K在大肠杆菌中表达受限制的因素 ,完全可以由增加稀有tRNA的数量来克服 .免疫印迹分析DscuPA 32K具有良好的抗原性 .此表达菌株可能有利于含大肠杆菌稀有密码子的真核基因在大肠杆菌中的表达 .

血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶融合产物活性分析

人工合成了血纤蛋白粘附肽基因，构建了粘附肽与低分子量单链尿激酶ｃＤＮＡ的融合基因，在大肠杆菌中表达了融合基因。融合基因表达产物的抗原性和天然尿激酶相同，并具有尿激酶的溶纤活性和粘附肽的抗纤维蛋白单体聚合的功能。

镧、铈对低分子量单链尿激酶基因在酵母中表达的影响

LaCl3能提高rscu PA 3 2k在酵母中的表达效率 ,2和 5mmol·L- 1 LaCl3可以使表达产物活力提高 13 %和 2 0 % ,从 14 6U/ml分别增加到 16 5和 17 5U/ml;而CeCl3则使表达产物的活力降低 ,2和 5mmol·L- 1 CeCl3分别使产物活力下降了 2 1%和 3 3 % ,从 14 6U/ml分别下降到 11 5和 9

水蛭素12肽与低分子量单链尿激酶融合基因的构建、表达及产物特性分析

用化学合成的方法合成了水蛭素12肽基因的编码序列,通过DNA重组技术将水蛭素12肽基因片段与低分子量单链尿激酶cDNA片段连接构建了融合基因。融合基因在大肠杆菌中获得表达。体外实验结果表明,表达的融合蛋白具有溶纤活性和抗凝活性。

血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶融合基因在大肠杆菌中的表达

人工合成了血纤蛋白粘附肽基因,构建了粘附肽与低分子量单链尿激酶cDNA的融合基因,在大肠杆菌中表达了融合基因。融合基因表达产物的抗原性和天然尿激酶相同,并具有尿激酶的溶纤活性和粘附肽的抗纤维蛋白单体聚合的功能。

低分子量单链尿激酶与血纤蛋白粘附肽融合基因的构建、表达及产物活性分析

低分子量单链尿激酶(scu-PA-32)可通过激活纤溶酶原转变成纤溶酶溶解血栓,其溶栓具有一定的选择性,出血副作用比双链尿激酶小,但缺少对纤维蛋白的特异亲和力;2种血纤蛋白粘附肽(四肽A4;十二肽A12)都可和纤维蛋白特异性地结合,具有抗纤维蛋白单体聚合的功能,并因此有一定的抗血栓形成作用。

溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达

将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥功能 .根据大肠杆菌偏好密码子合成 Decorsin的基因 ,与 scu PA-3 2 k基因融合在一起 ,构建新的嵌合体基因 dscu PA,并在大肠杆菌中通过 IPTG进行诱导表达 ,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在 .对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质 .用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为 92 0 0 0 IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似 ,且有较强的抑制血小板聚集的功能 .重组蛋白 dscu PA不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 .

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合基因的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

采用 DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法 ,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株 ( CHO- dhfr-)中 ,利用选择培养基筛选出稳定表达的细胞株 ,溶解圈法测定融合蛋白的表达水平为每 1 0 6细胞每天 5 8IU。该融合蛋白保留了与纤维蛋白的结合活性和溶解纤维蛋白的溶纤活性。SDS- PAGE,Western印迹法分析证明融合蛋白的相对分子质量约为 70× 1 0