低变性温度共扩增PCR及其衍生技术的研究进展

低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低廉等优点。该技术及其衍生技术能够优先富集高野生背景下已知或未知的少量突变,在肿瘤个体化诊断、无创性产前诊断、HBV基因型耐药监测等领域具有广泛的应用前景。本文对此类技术及应用进展作一综述,旨在为其临床及实验室应用提供参考。

提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

聚合酶链式反应(PCR)技术仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面。目前PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb,这在生物学研究特别是在基因组图谱的绘制和测序中将起到革命性作用。扩增片段的能力达到近20～50kb,也将具有其它潜在的应用价值,如可以分离出完整的基因。

TaqMan探针结合COLD-PCR原理定量检测JAK2 V617F突变率研究

目的建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的方法。方法应用TaqMan/MGB探针技术,结合较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应(COLD-PCR)基因扩增原理,采用Real-Time PCR分析系统,通过JAK2V617F突变率和其循环阈值(Ct值)的标准曲线,建立TaqMan-COLD-PCR测定方法,并对9例骨髓增殖性疾病(MPD)患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测,探讨其应用价值。结果建立的TaqMan-COLD-PCR方法检测JAK2V617F突变率的检测下限为0.1%,100%-0.1%的JAK2V617F突变率与其测定的Ct值间呈明显的线性关系。对9例MPD患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中6例患者的JAK2V617F突变阳性,突变率范围为18.5%-50.9%,经测序确认全部符合。结论 TaqMan-COLD-PCR方法可高灵敏度、定量检测外周血中JAK2V617F突变率。该方法将明显提高MPD疾病的诊断灵敏度,并有助于疾病治疗过程中治疗效果的监测。

多基因联合检测在判断膀胱癌预后价值中的意义

目的:探讨膀胱癌低级别与高级别两条通路在发生发展过程中的分子变化规律。方法:应用PCR或低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)与Sanger直接测序法检测88例膀胱癌及10例对照组织中fgfr3、p53与h-ras基因突变状况,以及MRP-1/CD9mRNA表达水平及各基因与肿瘤复发之间的关系。Logistic回归及相关性分析比较各基因在肿瘤复发中的意义及相互关系。结果:癌组织中p53突变率随病理分期及分级的增加而增加,MT-p53患者复发率高于WT-p53;fgfr3突变率则与之相反;低级别病理分期及分级膀胱癌以MT-fgfr3/WT-p53基因型为主,高级别病理分期及分级膀胱癌以WT-fgfr3/MT-p53基因型为主。h-ras突变率为11.4%(10/88),主要分布于低级别病理分期及分级膀胱癌中。MRP-1/CD9 mRNA表达随病理分期及分级的增高而降低,其表达与p53突变率呈负相关,与fgfr3突变率呈正相关。在膀胱癌患者中WT-fgfr3复发危险为MT-fgfr3的3.88倍,MT-p53复发危险为WT-p53的4.53倍。结论:低级别病理分期及分级膀胱癌发生发展中以fgfr3及h-ras基因突变为主,高级别病理分期及分级肿瘤以p53基因突变、MRP-1/CD9 mRNA表达降低为主。fgfr3与p53突变是预测膀胱癌复发的有力指标,在膀胱癌发生发展中分别代表不同的遗传学通路,但低级别与高级别两通路有互相重叠。

通过富集母血浆中胎儿游离DNA无创性产前诊断β地中海贫血

目的:评价富集母血浆中胎儿游离DNA的实验平台在母血浆中富集、鉴定胎儿游离DNA的适用范围。方法:(1)筛选与父源性β地中海贫血基因连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点:利用Haploview软件对20例β地中海贫血患者(其中CD41-42型11例,IVS-II-654型9例)的β地中海贫血基因(HBB基因)进行SNP与单倍型自动化分析,检索出HBB基因内杂合度较高的SNP位点并检测与CD41-42位点及IVS-II-654位点连锁的SNP位点。(2)选取4例孕妇外周血标本,且夫妇双方为不同的β地中海贫血基因类型,利用快速耐受温度-低变性温度共扩增PCR技术(TT-FAST-COLD-PCR)检测父源性β地中海贫血基因类型为IVS-II-654型的孕妇外周血标本,若未直接检测到IVS-II-654位点,则检测仅与IVS-II-654位点连锁的SNP位点;同样的原理,利用完全耐受温度-低变性温度共扩增技术(TT-FULL-COLD-PCR)检测父源性β地中海贫血基因类型为CD41-42型的孕妇外周血标本;同时利用普通PCR技术对上述标本进行检测。结果:(1)检测出IVS-II654位点与rs7480526位点连锁9例;CD41-42位点与rs10768683位点连锁11例;(2)通过TT-FAST-COLD-PCR技术在孕妇外周血中检测出1例父源性致病突变基因(IVS-II-654位点),另外1例未直接检测到父源性致病突变基因,但检测到与其连锁的SNP位点(rs7480526位点),与羊水细胞培养检测结果一致,检出率为100%(2/2);通过TT-FULL-COLD-PCR技术在孕妇外周血中检测出2例父源性致病突变基因(CD41-42位点),与羊水细胞培养检测结果一致,检出率为100%(2/2);而普通PCR技术均未检测到上述父源性致病突变基因及与父源性等位基因连锁的SNP位点。结论:TT-COLD-PCR技术适用于富集母血浆中胎儿游离DNA突变,可用于无创性产前诊断单基因遗传病。

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系:即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;TaqDNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。

中国人结直肠癌454例K-ras基因突变状态分析

目的:分析结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者肿瘤组织或血浆样本中K-ras基因突变状态,以促进针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向药物(如西妥昔单抗和帕尼单抗等)应用于CRC个体化治疗。方法:采用低变性温度下复合扩增聚合酶链反应(coamplication at lower denaturation temperature PCR,COLD-PCR)再结合测序的方法,定点分析431例中国CRC患者的肿瘤组织和另外23例CRC患者的血浆中K-ras基因序列结构,计算K-ras基因突变率。对不同CRC样本及不同年龄患者群的K-ras基因突变频率,采用χ2检验进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:在431例CRC患者的肿瘤组织中,K-ras基因发生突变的总体频率为25.29%;其中2种主要形式的突变为G12D(第12密码子由甘氨酸突变为天冬氨酸)和G13D(第13密码子由甘氨酸突变为天冬氨酸),它们发生的频率分别是12.99%和6.26%。而在23例CRC患者血浆中检出K-ras基因突变的发生频率为21.74%,其与肿瘤组织中的总突变率无明显差异(P>0.05)。在60岁及以上的CRC患者中,检测出任一种K-ras基因突变的可能频率为37.94%,显著高于60岁以下CRC患者的检出率(7.30%,P<0.01)。结论:采用COLD-PCR扩增再结合测序的方法检测K-ras基因突变状态时,在缺乏CRC肿瘤组织的情况下可以采用血浆样本来代替。另外,鉴于60岁及以上的CRC患者更易发生K-ras基因突变,建议对这些老年患者在治疗前须先常规检测K-ras基因突变状态。