基于NOD样受体3炎性小体通路对利拉鲁肽在氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤的作用机制研究

背景动脉粥样硬化是世界范围内引起心脑血管疾病最主要的原因,炎症是目前研究热点,其中NOD样受体3(NLRP3)是研究最为深入的炎症小体。胰高糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂有抗动脉粥样硬化作用,具体机制尚不明确。目的研究利拉鲁肽通过拮抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的内皮细胞损伤的作用机制。方法2022-03-25—05-19培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),取HUVEC加空白血清作为对照组,100μg/mL的ox-LDL干预HUVEC 48 h作为模型组,100μg/mL的ox-LDL干预HUVEC 24 h后分别加入100、200、400 nmol/L利拉鲁肽处理24 h作为利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组。CCK-8法计算细胞增殖率。通过扫描电镜观察焦亡细胞形态。检测乳酸脱氢酶(LDH)活力。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白介素(IL)-1β、IL-18表达水平。蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测NLRP3、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、焦亡执行蛋白(GSDMD)、N端结构域的焦亡执行蛋白(N-GSDMD)表达水平。结果模型组、利拉鲁肽低浓度组和利拉鲁肽中浓度组细胞增殖率低于对照组,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组细胞增殖率高于模型组(P<0.05)。细胞扫描电镜结果示模型组细胞焦亡明显,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组细胞焦亡情况明显改善。模型组、利拉鲁肽低浓度组LDH活力高于对照组,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组低于模型组(P<0.05)。模型组、利拉鲁肽低浓度组IL-1β表达水平高于对照组,利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组IL-1β表达水平低于模型组(P<0.05);模型组IL-18表达水平高于对照组,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组IL-18表达水平低于模型组(P<0.05)。模型组NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表达水平高于对照组,利拉鲁肽低浓度组ASC、Caspase-1表达水平高于对照组,利拉鲁肽中浓度组NLRP3、ASC表达水平低于模型组,利拉鲁肽高浓度组NLRP3、ASC、Caspase-1表达水平低于模型组(P<0.05)。结论利拉鲁肽显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞NLRP3炎性小体活化,并且能够抑制内皮细胞的焦亡,具有抗动脉粥样硬化作用。

低密度脂蛋白受体3′非翻译区单核苷酸多态性对黄连素调节低密度脂蛋白受体表达的影响

目的:中药黄连素具有降低血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的作用,其作用机制是否与低密度脂蛋白受体(LDLR)的单核苷酸多态性(SNP)有关尚不清楚。现探讨LDLR3′非翻译区(LDLR 3-′UTR)的SNP对黄连素调节LDLR表达的影响。方法:收集113例高脂血症合并冠心病患者,提取外周血基因组DNA,检测LDLR 3′-UTR的SNP,分析LDLR 3-′UTR的基因型与中国人群血脂水平的关系。此外,构建了携带不同LDLR 3-′UTR基因型(TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的荧光素酶报告基因载体(pLuc),转染HepG2细胞后采用黄连素(Berberine,BBR)作用12h后观察pLuc的活性变化。结果:中国人群的LDLR 3-′UTR存在着Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等SNP分布,但这些基因型频率与中国人群的血脂水平无明显相关性,携带有不同SNP基因型的荧光素酶报告基因载体转染HepG2细胞,在BBR作用后LDLR表达上调程度相似。结论:LDLR 3-′UTR的基因型频率及其分布的遗传性变异不能影响BBR对LDLR表达的上调作用,从而可为临床使用黄连素治疗高脂血症提供理论依据。

血清脂蛋白相关磷脂酶A2、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3与老年冠心病Syntax积分的相关性

目的探讨血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA_(2))与老年冠心病患者Syntax积分的相关性。方法选取2018年1月至2020年4月濮阳市人民医院收治的114例冠心病患者作为观察组,再选取同期在濮阳市人民医院接受体检的108例健康者作为对照组。比较两组血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平,比较Syntax积分及主要不良心血管事件(MACE)发生情况,比较不同Syntax积分及不同MACE发生情况患者的血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平,分析血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平与Syntax积分的相关性以及血清NLRP3、Lp-PLA_(2)联合检测对发生MACE的预测价值。结果观察组血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平高于对照组(P<0.05)。随着Syntax积分升高,血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平逐渐升高(P<0.05);血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平与Syntax积分呈正相关(P<0.05);发生MACE患者血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平高于对照组(P<0.05);ROC曲线显示血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平联合检测的AUC值大于任意单一检测(P<0.05)。结论冠心病患者血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平升高,其水平与病变严重程度密切相关。通过检测NLRP3、Lp-PLA_(2)水平可预测冠心病患者MACE的发生风险。

敲低低密度脂蛋白受体相关蛋白1抑制C3H10T1/2多潜能干细胞定向成脂

C3H10T1/2多潜能干细胞成脂过程分为定向和分化两个阶段,骨形成蛋白4(BMP4)可以诱导其定向成前脂肪细胞.已有的研究表明,脂肪组织特异性敲除低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1)的小鼠体重减轻,脂肪组织含量减少,揭示此基因对成脂具有重要作用.然而,目前尚不清楚Lrp1是否在成脂定向过程中发挥作用.采用小干扰RNA技术(RNAi),在体外水平研究低密度脂蛋白Lrp1对C3H10T1/2多潜能干细胞成脂定向的作用.分别在C3H10T1/2成脂的定向期和脂滴成熟期敲低Lrp1,通过显微镜下观察、油红O染色、Western blotting等实验证实,定向期而非脂滴成熟期敲低Lrp1显著抑制C3H10T1/2多潜能干细胞成脂.BMP4通过激活下游Smad1/5/8信号通路发挥作用,而敲低Lrp1显著抑制BMP4诱导的Smad1/5/8磷酸化.这些结果说明:敲低Lrp1通过下调Smad信号通路,抑制BMP4诱导的C3H10T1/2多潜能干细胞成脂定向.

酒精性心肌病大鼠模型中凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1表达与细胞凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3表达关系研究

目的:分析酒精性心肌病(ACM)大鼠模型中凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的表达情况及与细胞凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3表达量变化的相关性。方法:选用2周龄的健康雄性SD大鼠9只,随机分为三组:(1)正常对照组(Blank组);(2)酒精性心肌病组(ACM组);(3)酒精性心肌病+shRNA干预组(ACM+shRNA组),采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)分别在基因及蛋白水平检测LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3的表达量并采用Pearson检验分析其相关性。结果:与Blank组相比,ACM组心肌组织中LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3的表达量显著增加(P<0.01);与ACM组比较,ACM+shRNA组心肌组织中LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3的表达量明显减少(均P<0.01);相关性分析提示LOX-1的表达量与Bax、Cleaved caspase-3的表达量呈正相关(r=0.323、0.370,均P<0.05)。结论:酒精性心肌病大鼠模型心肌组织中LOX-1的表达量升高,且与Bax、Cleaved caspase-3的表达量呈正相关;LOX-1可能通过上调Bax、Cleaved caspase-3的表达参与酒精诱导心肌细胞凋亡的过程。

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1与酒精性心肌病细胞模型的关系研究

目的探讨酒精性心肌病(ACM)细胞模型中凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)对细胞凋亡有关蛋白Bcl-2相关蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3(Cleaved Caspase-3)表达量变化的影响。方法选用若干取对数生长期的细胞,随机分为以下6组:正常对照组(Blank组)、酒精性心肌病组(ACM组)、ACM+sh-NC抑表达对照组(ACM+sh-NC组)、ACM+sh-LOX-1组、ACM+OE-LOX-1过表达组(ACM+OE-LOX-1组)、ACM+OE-LOX-1+si-NC组。除Blank组外,其余各组细胞均用200 mmol/L酒精孵育1 d,体外诱发ACM细胞模型。应用Western blot、实时定量PCR技术分别在蛋白质及基因水平检测细胞中的LOX-1、Bax、Cleaved Caspase-3的表达量并采用Pearson积矩相关系数检验分析其相关性。结果与Blank组相比,ACM组心肌组织中LOX-1、Bax、Cleaved Caspase-3的mRNA表达量显著增加(P<0.01),蛋白表达量同样显著增加(P<0.05);对LOX-1表达进行干预处理后与ACM组及ACM+sh-NC组比较,ACM+sh-LOX-1组心肌组织中Bax、Cleaved Caspase-3的表达量显著减少(P<0.01);与ACM组相比较,ACM+OE-LOX-1组心肌组织中Bax、Cleaved Caspase-3的表达量显著升高(P<0.01);相关性分析提示LOX-1的表达量与Bax、Cleaved Caspase-3的表达量呈正相关(r=0.663,P<0.05;r=0.604,P<0.05)。结论LOX-1在ACM细胞模型中的表达量升高,且与心肌细胞凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达呈正相关,并通过干预Bax、Cleaved Caspase-3表达参与酒精诱导心肌细胞凋亡的过程。

Idol:一个新的通过转录后途径调节低密度脂蛋白受体的蛋白

肝脏的低密度脂蛋白受体(LDLR)是清除血浆低密度脂蛋白(LDL)的主要途径,并且是一个非常重要的心血管系统疾病的治疗靶点。LDLR的表达量受到转录和转录后两方面的调控。这里介绍一种新近发现的、通过泛素化作用经转录后途径调控LDLR的蛋白Idol(inducible degrader of the LDLR)。Idol是一个肝脏X受体(LXR)的靶分子,具有E3泛素连接酶活性,可以介导LDLR的泛素化,并在溶酶体降解。Idol还有另外两个LDLR家族的靶蛋白VLDLR和ApoER2。尽管Idol和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)存在着很多相似之处,但它们在调控LDLR的途径上是不同的。最近的工作显示Idol与人类的LDL水平有关,Idol可能在人类的血脂代谢有重要作用。

异鼠李素对氧化型低密度脂蛋白所致内皮细胞凋亡的影响

目的观察异鼠李素对氧化型低密度脂蛋白所致内皮细胞凋亡的保护作用,并对其作用机制进行探讨。方法采用MTT法测定细胞活力,试剂盒测定乳酸脱氢酶含量,Griess法测定一氧化氮含量,JC-1、吖啶橙和溴化乙啶荧光染色法对其线粒体膜电位及细胞存活情况进行分析,流式细胞术评价细胞凋亡率,半定量RT-PCR法检测凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1和Caspase-3 mRNA的表达。结果异鼠李素(10-7μmol/L、10-6μmol/L和10-5μmol/L)预培养能显著抑制氧化型低密度脂蛋白所致内皮细胞活力降低、线粒体乳酸脱氢酶释放增加及一氧化氮释放降低(P<0.05),明显抑制氧化型低密度脂蛋白所致线粒体膜电位降低和细胞凋亡,并呈剂量依赖性;异鼠李素(10-7μmol/L、10-6μmol/L和10-5μmol/L)能显著抑制氧化型低密度脂蛋白所致凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1和Caspase-3 mRNA表达升高(P<0.01),并呈一定的量效关系。结论异鼠李素对氧化型低密度脂蛋白所致内皮细胞凋亡呈现显著的保护作用,其机制可能与抑制氧化型低密度脂蛋白损伤引起的凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1和Caspase-3 mRNA表达上调以及一氧化氮释放降低有关。

正五聚蛋白3与缺血性卒中患者颈动脉狭窄的关系研究

目的通过分析急性缺血性卒中患者血浆正五聚蛋白3(pentraxin 3,PTX3)和凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)与颈动脉狭窄的关系,探索PTX3在颈动脉狭窄形成过程中的作用。方法前瞻性连续纳入2019年1-8月于首都医科大学附属北京友谊医院神经内科治疗的急性缺血性卒中患者,收集患者的基线资料、头颅CTA、血脂、PTX3、LOX-1等检查结果。根据患者头颅CTA有无颈动脉狭窄分为颈动脉狭窄组和无颈动脉狭窄组;以狭窄程度为标准,将颈动脉狭窄组患者分为严重狭窄(≥50%)组和轻度狭窄(<50%)组。采用单因素分析和多因素Logistic回归分析颈内动脉狭窄的独立危险因素。结果共纳入102例患者,颈动脉狭窄组57例(55.9%),无颈动脉狭窄组45例(44.1%),颈动脉狭窄组中轻度狭窄32例(56.1%),严重狭窄25例(43.9%);颈动脉狭窄组的缺血性脑血管病家族史比例、LDL-C、PTX3及LOX-1水平均高于无颈动脉狭窄组(均P<0.05);严重狭窄组的PTX3、LOX-1及LDL-C水平均高于轻度狭窄组(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示PTX3(OR 3.11,95%CI 2.11~4.58,P=0.007)、LOX-1(OR 5.47,95%CI 2.89~10.13,P=0.017)和LDL-C(OR 5.35,95%CI 2.45~10.65,P=0.021)水平升高是颈动脉狭窄发生的独立危险因素。结论血浆PTX3、LOX-1和LDL-C水平升高是颈动脉狭窄的独立危险因素。

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1通过糖原合成酶激酶-3β/信号转导和转录激活因子3通路调控高糖诱导的心肌成纤维细胞纤维化的研究

目的 探讨凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)通过糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路调控高糖诱导的心肌成纤维细胞(CFs)纤维化的相关机制。方法 分离、培养及鉴定CFs,构建LOX-1 RNAi慢病毒载体(LV-LOX-1)及慢病毒空载体(LV-Con)并感染CFs。将细胞分为正常对照(NC)组、25 mmol/L葡萄糖的高糖(HG)组、高渗(HPG)组、LV-LOX-1组和LV-Con组,LV-LOX-1及LV-Con感染CFs后加入HG培养24h,记为HG+LV-LOX-1组和HG+LV-Con组,分别使用10μmol/LSB216763和10μmol/L STATTIC处理HG+LV-LOX-1、HG+LV-Con组24h,记为HG+LV-LOX-1+SB216763组、HG+LV-Con+SB216763组、HG+LV-LOX-1+STATTIC组和HG+LV-Con+STATTIC组。CCK-8法检测CFs活力,q RT-PCR和Western blot法检测LOX-1、I型胶原(COL-I)、硫氧还蛋白5(TXNDC5)、GSK-3β、STAT3、p-GSK-3β、p-STAT3 mRNA和蛋白表达。结果 获得LV-LOX-1感染的CFs,荧光显微镜下呈绿色。与HG、HG+LV-Con组比较,HG+LV-LOX-1组LOX-1、COL-I、TXNDC5m RNA表达降低(P<0.05)。与HG+LV-LOX-1组比较,HG+LV-LOX-1+SB216763、HG+LV-LOX-1+STATTIC组COL-I、TXNDC5 mRNA表达降低(P<0.05)。与HG、HG+LV-Con组比较,HG+LV-LOX-1组p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05),LOX-1、p-STAT3、COL-I、TXNDC5蛋白表达降低(P<0.05)。与HG+LV-LOX-1组比较,HG+LV-LOX-1+SB216763组p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05),HG+LV-LOX-1+SB216763、HG+LV-LOX-1+STATTIC组p-STAT3、COL-I、TXNDC5蛋白表达降低(P<0.05)。结论 LOX-1、GSK-3β、STAT3、TXNDC5、COL-I参与高糖诱导的CFs纤维化,LOX-1通过GSK-3β/STAT3通路促进TXNDC5和COL-I表达,抑制LOX-1可抑制高糖诱导的CFs纤维化。

NSD3促进组蛋白H3K36双甲基化抑制巨噬细胞中TNF-α的产生

目的主要研究巨噬细胞中核受体结合SET结构域蛋白3(NSD3)对脂多糖(LPS)触发的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的调控作用,并探讨其调控机制。方法以小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264. 7细胞作为细胞模型。100 ng/m L LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞,采用实时定量PCR检测NSD3 mRNA水平,Western blot法检测NSD3蛋白水平;在RAW264. 7细胞中过表达NSD3或采用RNA干扰技术敲低腹腔巨噬细胞中NSD3的表达,ELISA检测NSD3对LPS触发的TNF-α分泌的影响; Western blot法检测敲低NSD3对LPS触发的核因子κB p65(NF-κBp65)信号通路的影响;荧光素酶法检测NSD3对NF-κBp65介导的TNF-α基因转录活性的影响;染色质免疫沉淀实验检测TNF-α基因启动子区组蛋白H3的36位赖氨酸(H3K36)甲基化的募集。结果 LPS抑制巨噬细胞中NSD3的表达;过表达NSD3抑制LPS触发的TNF-α的产生,敲低NSD3则促进LPS触发的TNF-α的产生,但对NF-κB活化无影响; NSD3抑制NF-κBp65介导的TNF-α基因的转录活化,促进TNF-α基因启动子区的H3K36二甲基化。结论 NSD3促进TNF-α基因启动子区H3K36的双甲基化,抑制TNF-α的表达。

舒芬太尼调节AMPK/TXNIP/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肺泡上皮细胞焦亡的影响

目的探讨舒芬太尼通过调节腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖诱导的肺泡上皮细胞焦亡的影响。方法将人肺泡上皮Ⅱ型细胞(AECⅡ)细胞培养至对数期,然后分为对照组(正常葡萄糖培养)、脂多糖组(50μg/mL脂多糖诱导损伤)、低浓度舒芬太尼组(20μmol/L)、高浓度舒芬太尼组(40μmol/L)、高浓度舒芬太尼(40μmol/L)+AMPK-IN-3组(50μmol/L AMPK抑制剂)。MTT法检测细胞增殖能力,Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)双染色检测细胞焦亡,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR检测细胞焦亡相关因子半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、焦孔素D(GSDMD)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测细胞中AMPK、磷酸化腺苷单磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、TXNIP、NLRP3蛋白表达。结果与对照组比较,脂多糖组AECⅡ细胞的细胞存活率降低,PI+阳性细胞增多,炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α释放增加,Caspase-1、ASC、GSDMD mRNA表达增加,p-AMPK/AMPK表达减少,TXNIP、NLRP3表达增加(P<0.05)。与脂多糖组比较,低浓度舒芬太尼组、高浓度舒芬太尼组AECⅡ细胞的细胞存活率升高,PI+阳性细胞减少,炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α释放减少,Caspase-1、ASC、GSDMD mRNA表达降低,p-AMPK/AMPK表达增多,TXNIP、NLRP3表达减少(P<0.05)。与高浓度舒芬太尼组比较,高浓度舒芬太尼+AMPK-IN-3组AECⅡ细胞存活率降低,PI+阳性细胞增多,炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α释放增加,Caspase-1、ASC、GSDMD mRNA表达增加,p-AMPK/AMPK表达减少,TXNIP、NLRP3表达增加(P<0.05)。结论舒芬太尼可能通过调控AMPK/TXNIP/NLRP3信号通路改善脂多糖诱导的肺泡上皮细胞焦亡。

阿尔茨海默病小鼠模型中TRPC3通过上调ZO-1和LRP-1蛋白表达清除β淀粉样蛋白沉积

目的 探讨阿尔茨海默病(AD)小鼠模型中经典瞬时受体电位通道3 (TRPC3)和血脑屏障(BBB)在β淀粉样蛋白(Aβ)沉积清除中的关系。方法 将60只小鼠随机分为假手术组、模型组、二酰基甘油类似物(OAG)组和吡啶化合物(Pyr3)组,每组15只。侧脑室注射Aβ1-42建立AD小鼠模型。OAG组和Pyr3组小鼠分别连续21 d腹腔注射TRPC3激动剂OAG和抑制剂Pyr3。应用Morris水迷宫实验检测小鼠行为学,伊文思蓝(EB)染色检测小鼠BBB通透性,Western blotting检测小鼠紧密连接蛋白(ZO-1)、Aβ转运受体低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP-1)表达水平,ELISA测定小鼠海马和血清Aβ1-42浓度。结果 与假手术组比较,模型组小鼠学习记忆能力下降(P <0.001),EB含量增加(P <0.05),ZO-1、LRP-1蛋白表达下降(均P <0.01),脑组织和血清Aβ浓度均升高(P <0.01,P <0.05);与模型组比较,OAG组小鼠的学习记忆能力明显改善(P <0.05),EB含量下降(P <0.05),ZO-1、LRP-1蛋白表达增加(均P <0.05),脑组织Aβ浓度下降(P <0.05),血清Aβ浓度升高(P <0.05)。结论 AD小鼠中,TRPC3可能通过恢复BBB通透性和功能,上调ZO-1和LRP-1蛋白表达,加快脑组织对Aβ沉积的清除,从而改善AD行为学症状。

正五聚蛋白3、LOX-1与动脉粥样硬化小鼠认知功能相关性的研究

目的探讨动脉粥样硬化小鼠的认知功能与正五聚蛋白3(PTX3)、凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)相关性。方法C57小鼠10只作为对照组,载脂蛋白E基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠正常饮食组10只,高脂饮食组10只。3组小鼠饲养16周后进行Morris水迷宫实验,评估小鼠空间学习和记忆能力。采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血浆中甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇(TC)水平。随后分离小鼠主动脉及双侧颈总动脉,取主动脉起始至左锁骨下动脉开口段进行石蜡切片,苏木精-伊红染色后测量小鼠主动脉动脉粥样硬化面积和管腔面积,蛋白质印迹法检测其余动脉组织中PTX3和LOX-1蛋白含量。结果水迷宫结果显示,高脂饮食组小鼠逃避潜伏期较正常饮食组、对照组均显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,正常饮食组和高脂饮食组ApoE^(-/-)小鼠的TG、LDL-C和TC水平均增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。正常饮食组和高脂饮食组ApoE^(-/-)小鼠的PTX3和LOX-1蛋白表达含量也均较对照组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组主动脉未见动脉粥样硬化病变形成,苏木精-伊红染色正常,高脂饮食组ApoE^(-/-)小鼠的动脉斑块面积较正常饮食组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示PTX3和LOX-1水平升高均是认知功能减退的独立危险因素(OR=3.12,95%CI:2.01~4.18,P=0.009;OR=5.40,95%CI:2.45~10.53,P=0.023)。结论随着动脉粥样硬化的加重,小鼠认知功能减退更加明显,PTX3和LOX-1与动脉粥样硬化小鼠认知功能障碍存在相关性。

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1对乙醇诱导的大鼠心肌细胞自噬的影响

目的探讨乙醇诱导下大鼠心肌细胞模型中凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1,LOX-1)的表达及其与自噬相关蛋白Beclin-1和自噬微管相关蛋白轻链3抗体Ⅱ(autophagy microtubule-associated protein light chain 3 antibodyⅡ,LC3-Ⅱ)的相关关系。方法选取对数生长期的大鼠心肌细胞随机分为以下6组:Blank组、乙醇组、乙醇+sh-NC组、乙醇+sh-LOX-1组、乙醇+OE-LOX-1组和乙醇+OE-LOX-1+si-NC组,除空白对照组外,其余各组细胞均用200 mmol/L酒精孵育1 d,体外构建乙醇诱导的大鼠心肌细胞模型。电镜观察自噬小体的数量。实时荧光定量PCR(Realtime PCR)和蛋白印迹法(Western blot)分别检测LOX-1、Beclin-1、LC3-I、LC3-Ⅱ在各组中的表达水平,并进行比较与分析。结果急性乙醇暴露后可使大鼠心肌细胞中LOX-1、Beclin-1、LC3-I和LC3-Ⅱ在基因和蛋白水平表达明显升高(P<0.01)。对LOX-1的表达抑制后,Beclin-1、LC3-I和LC3-Ⅱ表达明显下调(P<0.01),而在对LOX-1进行过表达处理后,则能够增加Beclin-1、LC3-I和LC3-Ⅱ的表达水平(P<0.01)。透射电镜下,急性乙醇摄入可造成大鼠心肌细胞中自噬小体增多;下调LOX-1后可减少自噬小体数量,而过表达LOX-1则会增加自噬小体数量(P<0.01)。结论LOX-1在急性乙醇诱导下的大鼠心肌细胞模型中表达上调,且与自噬相关因子(Beclin-1、LC3-Ⅱ)呈协同变化趋势,提示LOX-1可能通过上调Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平造成自噬水平的过度激活从而推动酒精致心肌损伤的病理过程。

丙泊酚对脂多糖诱导急性肾损伤小鼠的保护作用及Nrf2/HO-1/NLRP3通路的影响

目的:探讨丙泊酚对脂多糖(LPS)诱导急性肾损伤(AKI)小鼠的保护作用及核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nrf2/HO-1/NLRP3)通路的影响。方法:40只小鼠随机分为正常对照组、AKI模型组、丙泊酚组、Brusatol组、丙泊酚+Brusatol组。分析检测小鼠尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、肾脏系数、血清中氧化应激及肾组织中炎症因子水平、Nrf2/HO-1/NLRP3通路相关蛋白表达。结果:与正常对照组相比,AKI模型组小鼠肾脏系数、尿蛋白、血清BUN、Scr、MDA、肾组织损伤评分、肾组织炎症因子、NLRP3蛋白升高,血清SOD、GSH、肾组织Nrf2、HO-1蛋白降低(P<0.05)。与AKI模型组相比,丙泊酚组小鼠肾脏系数、尿蛋白、血清BUN、Scr、MDA、肾组织损伤评分、肾组织炎症因子、NLRP3蛋白降低,血清SOD、GSH、肾组织Nrf2、HO-1蛋白升高(P<0.05);Brusatol组则相反。与丙泊酚组相比,丙泊酚+Brusatol组小鼠肾脏系数、尿蛋白、血清BUN、Scr、MDA、肾组织损伤评分、肾组织炎症因子、NLRP3蛋白升高,血清SOD、GSH、肾组织Nrf2、HO-1蛋白降低(P<0.05)。结论:丙泊酚可改善LPS诱导的小鼠急性肾损伤,可能是通过激活Nrf2/HO-1/NLRP3通路实现的。

褪黑素调控NLRP3/caspase-1通路减轻脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞损伤

目的探讨褪黑素通过调节核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)通路对脂多糖(LPS)诱导的人肺泡上皮细胞(A549)损伤的影响。方法体外培养A549细胞,分为对照组、LPS组(10 mg/L LPS)、LPS+褪黑素组(LPS+MT组,10 mg/L LPS+800μmol/L褪黑素)、LPS+抑制剂组(10 mg/L LPS+10μmol/L MCC950)。应用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平;RT-qPCR法检测细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平;Western blot法检测细胞中NLRP3、caspase-1蛋白表达水平。结果与对照组比较,LPS组A549细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例降低,细胞凋亡率、G0/G1期比例、TNF-α、IL-1β、IL-6水平和NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,LPS+MT组与LPS+抑制剂组A549细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例显著升高,细胞凋亡率、G0/G1期比例、TNF-α、IL-1β、IL-6水平和NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论褪黑素可减轻LPS诱导的A549细胞损伤,其作用机制可能与抑制NLRP3/caspase-1信号通路有关。

绿原酸通过调控miR-223/NLRP3轴减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的机制

目的:绿原酸具有抗菌、抗炎、抗病毒等多种生理活性,研究显示绿原酸可缓解急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠机体炎症反应,但具体作用机制尚不明确。本研究旨在探讨绿原酸是否通过调控微RNA-223(microRNA-223,miR-223)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)轴来减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠ALI。方法:将SPF级BALBc雄性小鼠随机分为对照组、模型组、绿原酸组、绿原酸+miR-223阴性对照(miR-223 NC)组、绿原酸+miR-223抑制物(miR-223 antagomir)组,每组10只,除对照组,其余各组均通过气道滴入4 mg/kg的LPS制备ALI小鼠模型,造模成功后绿原酸组小鼠使用绿原酸(100 mg/kg)连续灌胃7 d。绿原酸+miR-223 NC组、绿原酸+miR-223 antagomir组每天灌胃100 mg/kg的绿原酸后分别经尾静脉注射10μL的miR-223 NC(0.5 nmol/μL)、miR-223 antagomir(0.5 nmol/μL),连续7 d。对照组和模型组用生理盐水替代。取小鼠肺组织,测定肺湿/干重比(W/D);收集小鼠肺泡灌洗液,采用ELISA试剂盒测定炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平;于光学显微镜下统计嗜酸性粒细胞(eosinophils,EOS)、淋巴细胞、中性粒细胞的数量;行HE染色后观察小鼠肺组织病理学变化并进行肺损伤评分;采用qRT-PCR法测定小鼠肺组织中miR-223的表达水平,蛋白质印迹法测定小鼠肺组织中NLRP3蛋白质的表达水平;采用荧光素酶报告实验分析miR-223与NLRP3的靶向关系。结果:与对照组相比,模型组小鼠肺W/D值、肺损伤评分、肺泡灌洗液中炎症因子水平显著升高(均P<0.05),肺组织炎症细胞浸润严重,肺泡空间明显增加,肺泡壁显著增厚,肺泡灌洗液中EOS、淋巴细胞、中性粒细胞数量显著增加(均P<0.05),肺组织中miR-223表达水平显著降低、NLRP3蛋白质表达水平显著升高(均P<0.05)。与模型组相比,绿原酸组、绿原酸+miR-223 NC组、绿原酸+miR-223 antagomir组小鼠肺W/D值、肺损伤评分、肺泡灌洗液中炎症因子水平显著降低(均P<0.05),肺组织损伤减轻,肺泡灌洗液中EOS、淋巴细胞、中性粒细胞数量显著减少(均P<0.05),肺组织中miR-223表达水平显著升高,NLRP3蛋白质表达水平显著降低(均P<0.05)。与绿原酸组相比,绿原酸+miR-223 antagomir组小鼠肺W/D值、肺损伤评分、肺泡灌洗液中炎症因子水平显著升高(均P<0.05),肺组织损伤加重,肺泡灌洗液中EOS、淋巴细胞、中性粒细胞数量显著增加(均P<0.05),肺组织中miR-223表达水平显著降低,NLRP3蛋白质表达水平显著升高(均P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-223与NLRP3存在靶向关系。结论:绿原酸可能通过提高miR-223水平,靶向抑制NLRP3表达,降低LPS诱导的ALI小鼠炎症反应,缓解肺组织病理损伤。

miR-370-3p和LRP6对胎儿生长受限孕妇的临床诊断价值

目的探讨微小RNA-370-3p(miR-370-3p)和低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)对胎儿生长受限(FGR)孕妇的临床诊断价值。方法选取2020年6月—2022年6月期间产检并确诊为FGR的孕妇96例为观察组,另选取同期产检的健康孕妇96例作为对照组,记录两组分娩孕周、1 min Apgar评分、5 min Apgar评分、新生儿体重、胎盘质量,依据美国妇产科学院(ACOG)标准将观察组划分为FGR组、严重FGR组。qRT-PCR法检测血清miR-370-3p和LRP6 mRNA表达水平;血清miR-370-3p和LRP6 mRNA水平与分娩孕周、1 min Apgar评分、5 min Apgar评分、新生儿体重、胎盘质量的相关性采用Pearson法分析;miR-370-3p和LRP6 mRNA对FGR的诊断价值采用ROC曲线评估。结果两组孕妇年龄、分娩孕周、是否初产的比例差异有统计学意义(P<0.05);观察组miR-370-3p显著高于对照组,LRP6显著低于对照组(P<0.05);严重FGR组miR-370-3p显著高于FGR组,LRP6显著低于FGR组(P<0.05);对照组与观察组新生儿体重、1 min Apgar评分、5 min Apgar评分及胎盘质量之间差异有统计学意义(P<0.05);miR-370-3p与LRP6之间呈负相关(r=-0.692,P<0.05),miR-370-3p与分娩孕周、新生儿体重、1 min Apgar评分、5 min Apgar评分、胎盘质量均呈负相关(r=-0.401、-0.382、-0.425、-0.484、-0.504,均P<0.05),LRP6与分娩孕周、新生儿体重、1 min Apgar评分、5 min Apgar评分、胎盘质量均呈正相关(r=0.306、0.412、0.512、0.612、0.419,均P<0.05);ROC曲线显示,miR-370-3p对FGR诊断的AUC为0.877(95%CI:0.821~0.919),截断值为1.40,其敏感度、特异性分别为67.71%、93.75%;LRP6对FGR诊断的AUC为0.838(95%CI:0.778~0.887),截断值为0.83,其敏感度、特异性分别为84.37%、71.87%;二者联合对FGR诊断的AUC为0.923(95%CI:0.875~0.956),明显高于二者单独诊断(Z联合vs miR-370-3P=2.811、P=0.005;Z联合vs LRP6=3.372、P=0.001),其敏感度、特异性分别为85.42%、87.50%。结论FGR患者血清miR-370-3p高表达、LRP6低表达,二者联合对FGR具有一定诊断价值。

乳脂球表皮生长因子8通过抑制活性氧簇/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体信号通路减轻移植肺缺血再灌注损伤

目的从活性氧簇(ROS)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体信号通路探讨乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)抗移植肺缺血再灌注损伤的作用机制。方法健康雄性SD大鼠50只,随机分为对照组、移植组和MFG-E8组,袖套改良法建立大鼠左肺移植模型。MFG-E8组受体鼠术前30min经尾静脉注射rhMFG-E820μg/kg,对照组和移植组受体大鼠尾静脉注射同等量生理盐水。肺移植再灌注2 h后阻断右肺门5min,全自动血气分析检测仪检测动脉血中氧分压(PaO_(2))和二氧化碳分压(PaCO_(2))。苏木精-伊红(HE)染色观察移植肺组织显微病理改变,原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测移植肺组织细胞凋亡指数。组织活性氧检测试剂盒(DHE)检测肺组织中ROS水平,干/湿法测量肺湿质量/干质量(W/D)比。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测肺组织NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(Caspase-1)、和凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)蛋白表达水平。酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)表达水平。组间比较使用t检验,多组比较采取单因素方差分析。结果再灌注2 h后,HE染色可见移植组肺组织明显炎性细胞浸润、肺泡结构破坏、肺水肿、肺泡腔内渗出明显伴有一些红细胞;MFG-E8组肺组织炎性细胞浸润明显减少,未见明显肺水肿,肺泡结构基本完整。再灌注2 h后,MFG-E8组动脉PaO_(2)/FiO_(2)显著高于移植组[(314.35±58.13)mmHg比(212.76±42.19)mmHg,t=4.473,P<0.05];MFG-E8组肺组织ROS水平、细胞凋亡指数和W/D值均明显低于移植组[102.37±20.78比145.72±29.34、(20.36±5.37)%比(28.13±4.64)%、6.15±1.23比8.51±1.83,t=3.813、3.462、3.385,P<0.05]。移植组大鼠肺组织NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白水平表达明显高于对照组(0.42±0.18比0.20±0.11、0.28±0.12比0.12±0.10、0.65±0.15比0.40±0.13,t=3.298、3.239、3.983,P<0.05);MFG-E8组大鼠肺组织NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白水平表达显著低于移植组(0.25±0.12比0.42±0.18、0.15±0.10)比(0.28±0.12、0.44±0.10比0.65±0.15,t=2.485、2.632、3.684,P<0.05)。移植组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18蛋白水平表达明显高于对照组[(105.74±34.73)pg/ml比(70.8±7.25)pg/ml、(128.56±23.82)pg/ml比(93.48±14.53)pg/ml,t=3.114、3.975,P<0.05];MFG-E8组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18蛋白水平表达显著低于移植组[(80.16±8.35)pg/ml比(105.74±34.73)pg/ml、(95.50±13.18)pg/ml比(128.56±23.82)pg/ml,t=2.265、3.840,P<0.05]。结论MFG-E8可能通过下调ROS/NLRP3信号通路,抑制NLRP3炎症小体活化,减轻氧化应激和免疫炎性反应,发挥抗移植肺缺血再灌注损伤作用。