低氧对炎性环境下髓核细胞凋亡的作用及机制

目的探讨低氧对炎性环境下髓核细胞凋亡的影响及作用机制。方法体外培养大鼠原代髓核细胞,采用低氧小室进行低氧干预,采用促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激髓核细胞模拟炎性环境。通过流式细胞术及TUNEL染色检测髓核细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白表达水平,明确低氧对髓核细胞凋亡的影响;随后通过荧光定量PCR及酶联免疫吸附试验评估炎性环境下髓核细胞内炎性反应情况,并通过蛋白质印迹法分析髓核细胞内NLRP3炎性小体激活水平;最后采用NLRP3炎性小体激动剂QS-21,通过回复实验明确NLRP3炎性小体在低氧调控髓核细胞凋亡中的作用。结果低氧对正常环境下髓核细胞凋亡无明显影响,但能抑制炎性环境下髓核细胞凋亡。在炎性环境下,髓核细胞炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-8、IL-18的表达及分泌增加,细胞内NLRP3炎性小体激活,而低氧干预能缓解上述改变。回复实验表明,NLRP3炎性小体激动剂QS-21可削弱低氧对炎性环境下髓核细胞凋亡的抑制作用。结论低氧通过抑制NLRP3炎性小体激活缓解炎性环境下髓核细胞凋亡。

藏红花素通过跨膜受体蛋白/发状分裂相关增强子1信号通路对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的探讨藏红花素对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的作用及其可能机制。方法于2021年1月至2022年1月采用不同浓度藏红花素处理视网膜神经节细胞RGC-5,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并用氯化钴(CoCl_(2))处理建立缺氧模型,分为缺氧组、藏红花素组、阳性对照(抗坏血酸)组和藏红花素+跨膜受体蛋白信号通路抑制剂(DAPT)组,另设对照组。Cell counting kit-8法检测细胞存活情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;钙荧光探针(Flou-4)实验检测各组细胞钙离子水平;实时定量PCR法检测跨膜受体蛋白(Notch1)、发状分裂相关增强子1(Hes-1)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、钙依赖性蛋白酶家族1(Cal⁃pain1)蛋白表达情况。结果藏红花素组细胞活力0.83±0.08高于缺氧组0.45±0.04,细胞凋亡率(17.92±1.21)%低于缺氧组(51.82±5.36)%,钙离子水平0.27±0.04低于缺氧组0.76±0.05,差异有统计学意义(P<0.05);藏红花素+DAPT组细胞活力0.50±0.06低于藏红花素组0.83±0.08,细胞凋亡率(36.50±3.50)%高于藏红花素组(17.92±1.21)%,钙离子水平0.65±0.05高于藏红花素组0.27±0.04,差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧组比较,藏红花素组Bcl-2蛋白表达水平升高,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与藏红花素组比较,藏红花素+DAPT组Bcl-2蛋白表达水平降低,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论藏红花素对体外培养的缺氧RGC-5细胞凋亡有一定的抑制作用,可能是通过抑制钙离子内流,阻滞Notch1/Hes-1通路,提高细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平发挥作用。

4-HMA对氧糖剥夺/复氧神经元细胞和大脑中动脉栓塞/再灌注小鼠脑组织损伤的保护作用及其机制

目的探讨4-羟基扁桃酸(4-HMA)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)致神经元细胞损伤以及大脑中动脉栓塞/再灌注(MCAO/R)致小鼠脑组织损伤的保护作用及其机制。方法提取原代神经元细胞,设立对照组(神经元培养基培养)、OGD/R组(OGD/R处理)及OGD/R+4-HMA组(给予OGD/R处理+4-HMA干预)。在各组细胞培养6 h后,采用Western blot法检测各组神经元细胞中白蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的水平,通过CCK-8实验检测各组细胞的细胞活力。将C57BL/6小鼠随机分为Sham组、MCAO/R组及MCAO/R+4-HMA组,每组6只。Sham组小鼠仅颈外动脉造口,但不阻塞其大脑中动脉;MCAO/R组和MCAO/R+4-HMA组小鼠均进行MCAO手术,栓塞大脑中动脉1.5 h恢复血流,MCAO/R+4-HMA组小鼠分别于血流恢复0、3 h时腹腔注射4-HMA,MCAO/R组小鼠不做任何处理。采用TTC染色法测定各组小鼠的脑梗死体积百分比并计算梗死区域占总脑体积百分比,并通过小鼠改良神经损伤评分(mNSS)对小鼠行为学进行评估。结果OGD/R、OGD/R+4-HMA组与对照组比较,细胞中p-Akt相对表达量、p-Akt/Akt比值显著性增高(F=10.49、8.87,t_(LSD)=3.02~3.14,P<0.05),Akt相对表达量差异无显著性(P>0.05)。OGD/R+4-HMA组的细胞活力明显高于OGD/R组(F=104.60,t_(LSD)=7.28,P<0.05)。相较于MCAO/R组,MCAO/R+4-HMA组小鼠的mNSS分值和脑梗死体积百分比均显著降低(F=7.20、108.00,t_(LSD)=3.32、5.41,P<0.05)。结论4-HMA能够减轻OGD/R模型致神经元细胞的损伤,降低MCAO/R小鼠的脑梗死体积百分比,其作用机制可能与提高脑神经元细胞中p-Akt水平有关。

LncRNA MIAT靶向miR-204对氧糖剥夺/复氧诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探究氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12细胞损伤的分子调控机制,以期为临床上靶向治疗缺血性卒中提供新的思路。方法该研究于2021年6—12月进行,购买PC12细胞后对其进行OGD/R诱导,在诱导后的细胞中分别转染长链非编码RNA(LncRNA)心肌梗死相关转录本(MIAT)过表达载体及微RNA-204模拟物(miR-204 mimic),以对应的载体阴性对照(pcDNA3.1-NC)或模拟物阴性对照(mimic-NC)作为阴性对照,以未转染PC12细胞作为空白对照。使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测LncRNA MIAT与miR-204的表达;CCK-8与流式细胞术分别检测细胞活力与凋亡;Elisa试剂盒检测炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β,抗炎性因子IL-10的表达。RNA下拉检测MIAT在miR-204上的富集;通过starbase预测LncRNA MIAT与miR-204的结合位点,随后采取双萤光素酶报告实验验证LncRNA MIAT与miR-204的靶向结合。结果与空白对照组[1.011±0.113,1.001±0.002,1.473±0.224,(8.16±0.84)%,(96.75±6.73)ng/L,(46.28±2.84)ng/L,(39.45±1.45)ng/L]相比,OGD/R组细胞中LncRNA MIAT表达显著降低(0.362±0.085),miR-204表达显著升高(2.234±0.306),细胞活力显著降低0.806±0.115,凋亡率显著增加[(28.25±4.13)%];炎性因子IL-6[(525.19±15.62)ng/L]、IL-1β[(292.54±19.54)ng/L]的表达显著增加,抗炎性因子IL-10的表达(14.33±2.36)ng/L显著降低(均P<0.01)。与阴性对照组相比[2.198±0.324,0.811±0.117,(8.16±0.84)%,(96.75±6.73)ng/L,(46.28±2.84)ng/L,(39.45±1.45)ng/L],MIAT过表达后OGD/R细胞中miR-204表达显著降低1.373±0.268,细胞活力显著升高1.137±0.116,凋亡率显著降低(28.25±4.13)%;炎性因子IL-6(525.19±15.62)ng/L、IL-1β(292.54±19.54)ng/L的表达显著降低,抗炎性因子IL-10(14.33±2.36)ng/L的表达显著升高(均P<0.01)。与MIAT过表达的OGD/R细胞相比,MIAT过表达载体和miR-204模型物共转染的OGD/R细胞中miR-204表达显著升高,细胞活力显著降低,凋亡率显著升高;炎性因子IL-6、IL-1β的表达显著升高,抗炎性因子IL-10的表达显著降低(均P<0.01)。结论在OGD/R诱导的PC12细胞中,低表达LncRNA MIAT促进miR-204表达上调,最终促进细胞损伤。

低氧对人肺腺癌A549细胞迁移和黏附的影响

目的:探讨低氧对人肺腺癌A549细胞迁移以及与血管内皮细胞黏附的影响。方法:细胞划痕实验和Transwell实验检测低氧对A549细胞迁移和浸润的影响;细胞黏附实验检测低氧对A549细胞与血管内皮细胞黏附的影响;免疫荧光法观察低氧对A549细胞中E-cadherin、β-catenin、纤维状肌动蛋白(F-actin)分布的影响;荧光素酶报告基因检测低氧对A549细胞中依赖于缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的转录活性的影响。结果:低氧可以促进A549细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附,影响A549细胞中E-cadherin和β-catenin的分布及F-actin细胞骨架的重排,上调A549细胞中依赖于HIF-1的报告基因的表达。结论:低氧促进A549细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附可能是通过调控A549细胞中依赖于HIF-1基因的表达,进而影响细胞中E-cadherin和β-catenin分布和F-actin细胞骨架的重排。

人体肝癌细胞急性低氧及低氧习服差异表达基因分析

本文分析了人体肝癌细胞 (HepG2 )急性低氧处理以及低氧习服处理后基因表达谱的改变。急性低氧处理为细胞在 1%氧气中培养 48h ,低氧习服处理为细胞在 1%氧气中培养 2 4h ,常氧培养 2 4h ,以此作为一个周期 ,重复 6个周期。联合应用抑制消减杂交技术和cDNA芯片技术 ,筛选HepG2细胞经急性低氧处理与正常培养细胞相比差异表达的基因 ,以及经低氧习服处理细胞与正常培养细胞相比差异表达的基因。结果显示 ,HepG2细胞经急性低氧处理与在常氧条件下培养相比 ,差异表达的基因有 3 7个 ,表达水平全部表现为下调 ,其中包括参与细胞周期、细胞应激、细胞信号转导、细胞骨架形成、转录相关蛋白及细胞代谢相关蛋白的基因 ,1个未知基因序列、4个EST序列、5个线粒体蛋白基因 ,另外有功能不明的蛋白质基因 12个。低氧习服处理的细胞与常氧条件下培养的细胞相比 ,差异表达的基因有 6个 ,其中包括两个线粒体蛋白基因、金属蛋白酶 1基因、转铁蛋白基因、Thymosin .beta 4和TPT1基因。其中线粒体蛋白ND4、转铁蛋白、Thymosin .beta 4和TPT1基因的表达呈上调 ,线粒体ND1及金属蛋白酶1基因的表达水平呈下调。经低氧习服处理后 ,细胞低氧耐受力提高 。

低分子肝素对低氧诱导的早孕细胞滋养细胞凋亡的影响

目的:研究低分子肝素对低氧诱导的早孕细胞滋养细胞凋亡的影响。方法:选取正常早孕(8～10周)绒毛,使用Percoll梯度离心法提取细胞滋养细胞在1%和20%氧分压下分别进行原代培养。两种氧条件下均设对照组与研究组。研究组培养液中加入不同浓度低分子肝素(终浓度为0.1U/ml、1U/ml、10U/ml),未加低分子肝素组作为对照组,将培养孔板分别置入1%和20%氧分压培养箱中培养120h。使用TUNEL法检测细胞凋亡,RT-PCR法检测凋亡基因表达。结果:(1)与20%氧分压条件下对照组相比,在1%氧分压下对照组的细胞滋养细胞的生长明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);(2)与对照组比较,1%和20%氧分压下研究组,细胞滋养细胞的生长均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);(3)与20%氧分压条件对照组相比,在1%氧分压下,对照组的细胞滋养细胞的凋亡明显增加,有显著差异(P<0.01);(4)在1%氧分压下,与对照组相比,研究组细胞滋养细胞的凋亡明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:低氧能促进早孕细胞滋养细胞生长,并诱导细胞滋养细胞凋亡;低分子肝素抑制低氧诱导的早孕细胞滋养细胞凋亡并促进其生长。

低氧诱导鼻咽癌细胞表达血管内皮生长因子

背景与目的:低氧是大多数实体瘤(包括鼻咽癌)肿瘤微环境中的一个普遍存在的现象。研究表明,低氧能诱导血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在神经胶质瘤(C6)等细胞中的表达。本实验研究低氧对VEGF在体外培养的鼻咽癌细胞株(CNE-2Z)表达的影响,并探讨其与肿瘤转移的关系。方法:建立CNE-2Z细胞体外低氧细胞培养模型。在低氧处理24h后,分别以RT-PCR和Westernblot方法检测VEGF基因在mRNA和蛋白质水平的表达变化。结果:RT-PCR证实CNE-2Z细胞表达VEGF189,VEGF165,VEGF145和VEGF121等4种VEGFmRNA同工型。此四种mRNA同工型在低氧处理24h后均表达增加,分别是常氧对照组的(2.67±0.30)、(2.05±0.03)、(2.73±0.15)和(1.65±0.01)倍。Westernblot显示,低氧实验组VEGF蛋白表达是常氧对照组的(2.20±0.07)倍。结论:CNE-2Z细胞表达VEGF基因。体外低氧处理能使CNE-2Z细胞中VEGF表达增加。

新型内皮素受体拮抗剂ETP-508对低氧培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨新型内皮素受体拮抗剂ETP-508对低氧培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响。方法贴壁原代培养的PASMCs分为4组:常氧组(氧浓度21%),低氧组(氧浓度2%),低氧+BQ-485组(BQ-485的终浓度分别为10-6、10-7、10-8、10-9mol/L),低氧+ETP-508组(ETP-508的终浓度分别为10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)。4组细胞均分别培养24、48、72h后,采用MTT法(波长492nm)检测BQ-485和ETP-508对PASMCs增殖的影响。按上述分组培养细胞48h,采用流式细胞仪测定细胞周期;放免法测定培养上清液中内皮素-1(ET-1)的含量。结果24h时各实验组A值差异不明显;48h时低氧组A值明显增加(P<0.01),低氧+BQ-485组、低氧+ETP-508组在10-8、10-7、10-6mol/L时A值下降,与低氧组比较有统计学意义(P<0.01);72h时低氧组A值仍高于常氧组,但较48h时略下降(P<0.05)。48h时低氧组G2、S期细胞比率、DNA合成增加,与常氧组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);与低氧组比较,低氧+BQ-485组、低氧+ETP-508组G2、S期细胞比率下降(P<0.05),G1期细胞增多(P<0.05),DNA合成减少。48h时低氧组ET-1水平增高(P<0.01),给予BQ-485、ETP-508后ET-1水平降低,10-7mol/L BQ-485、10-9mol/L ETP-508可明显降低ET-1水平(P<0.01)。结论ETP-508作为一种新型内皮素受体拮抗剂能抑制低氧培养PASMCs的增殖,减少ET-1的生成,且其作用较BQ-485强。

低氧条件小鼠胎肝间质细胞血管内皮生长因子的表达:对侧支和新血管生成的促进作用

目的:观察低氧培养条件下小鼠胎肝间质细胞中血管内皮生长因子的表达情况。方法:实验于2004-08/12在暨南大学医学院血液病研究所完成。取孕14.5d小鼠胚胎肝细胞进行贴壁培养及传代。生长至次融合状态的第5代细胞分别在体积分数0.95氮气和体积分数0.05二氧化碳混合气和常规条件下培养。在低氧和常氧培养后2,8,16,32h应用半定量反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹技术检测其血管内皮生长因子基因mRNA和蛋白表达。结果:低氧培养2h时聚合酶链反应产物血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养犤(9.83±3.41)%,(5.47±2.78)%,F=12.33,P<0.01犦;低氧培养8h时血管内皮生长因子mRNA水平达到高峰,为常氧培养的6.17倍;16h后血管内皮生长因子mRNA表达水平开始下降;32h时血管内皮生长因子mRNA表达水平进一步下降,血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养组犤(18.95±6.23)%,F=22.76,P<0.01犦。低氧培养4h时血管内皮生长因子蛋白已显著增加,血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养组犤(8.38±3.24)%,F=10.87,P<0.01犦;16h时达到高峰水平,β-肌动;32h时血管内皮生长因子水平显著下降,血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比仍明显高于常氧培养组犤(17.27±6.35)%,F=19.38,P<0.01犦。结论:低氧可诱导血管内皮生长因子在小鼠胎肝间质细胞中表达,提示低氧预处理间质细胞在组织缺血损伤如心肌缺血等疾病可能产生治疗作用。

低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖及重金属钴的作用

目的:观察低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的作用,并分析CoCl2对成肌细胞增殖的影响。方法:实验于2005-05/2006-07在解放军军事医学科学院基础医学研究所神经肌肉发育研究室完成。①低氧CO2温箱(Forma Scientific,美国);CoCl2(北京化工厂)。②选取4～5周龄Wistar雄性大鼠5只,脱颈处死无菌切取后腿肌群,剪除脂肪和筋膜,制备单细胞悬液。以连续贴壁法筛选大鼠骨骼肌成肌细胞,接种于96孔板进行单克隆培养。采用成肌细胞特异性标志抗原desmin免疫化学染色,鉴定成肌细胞标志蛋白——结蛋白的表达,弃去desmin阴性的细胞克隆,继续培养desmin阳性的细胞克隆,隔天换液1次,7d进行酶消化传代,获得大量扩增的细胞,并可冻存复苏,用于实验。③以1×107L-1接种于20个35mm培养皿中,接种细胞3h后,将培养皿随机数字表法分为5组:常氧对照组、轻度低氧组、中度低氧组、CoCl2组、轻度低氧+CoCl2组,4皿/组。常氧对照组置于体积分数为0.2的O2常规氧气环境中;轻、中度低氧组分别于低氧温箱中维持体积分数为0.1与0.03的O2低氧环境中;CoCl2组向培养皿中加入终浓度为15μmol/L的CoCl2;轻度低氧+CoCl2组向细胞培养皿中加入终浓度为15μmol/L的CoCl2后,放入体积分数为0.1的O2低氧温箱。低氧培养24,48,72h时,各组取出培养皿进行细胞消化离心,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,血球计数板计数法进行细胞计数。④以1×108L-1接种于8个60mm培养皿中,接种细胞3h后,将培养皿随机数字表法分为2组:常氧对照组、轻度低氧组,4皿/组。两组干预措施同细胞计数过程。低氧培养48h时,两组取出培养皿进行细胞消化离心,流式细胞仪检测细胞周期。结果:①骨骼肌成肌细胞的单克隆培养结果:成肌细胞可在体外存活6个月,增殖旺盛期约为3个月,可传代15次以上。单克隆培养2周后,可以由单个细胞长满96孔板中的1个孔,并不断扩增,最终可以得到细胞类型专一单克隆化的成肌细胞。②成肌细胞特异性标志抗原desmin鉴定结果:镜下不同视野desmin阳性率达100%,即培养的成肌细胞单克隆纯度达100%。③细胞计数结果:与常氧对照组比较,低氧培养24,48,72h时轻、中度低氧组均可明显促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖,且轻度低氧组作用尤为明显(t=4.98,P<0.001);CoCl2组无明显变化,但轻度低氧+CoCl2组细胞数量显著增加(t=4.62,P<0.001)。④细胞周期分布:与常氧对照组比较,低氧48h时轻度低氧组处于S期的细胞明显增多[(26.67±0.89)%,(65.43±0.23)%,t=2.36,P<0.01],且增殖指数亦显著上升(33.4%,67.1%,t=2.15,P<0.01)。结论:①轻中度低氧可以促进大鼠骨骼肌成肌细胞的增殖,为体外大量扩增细胞提供了新思路。②CoCl2对骨骼肌成肌细胞没有促增殖作用。

低氧浓度改变对神经干细胞增殖分化及HIF-1α表达的影响

目的:探讨不同的低氧浓度下离体培养胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的增殖分化及HIF-1α的表达情况,以此分析HIF-1α对神经干细胞的增殖分化作用。方法:体外低氧条件下(3%O2和10%O2)培养扩增胚鼠皮质来源的神经干细胞,实验组分为3%O2低氧1、3、5d组;10%O2低氧1、3、5d组,常氧为对照组。免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其子代细胞。RT-PCR检测实验组细胞HIF-1αmRNA的表达。结果:各低氧组NSCs内HIF-1αmRNA的表达量均明显高于对照组,且10%O2组与3%O2组相比,低氧5dHIF-1αmRNA的表达量显著增加;实验组NSE阳性神经元的比率均明显高于对照组,10%O2组与3%O2组相比,低氧5d10%O2组中NSE阳性神经元的比率明显增高。结论:低氧可促进NSCs增殖分化及HIF-1αmRNA的表达,且HIF-1αmRNA的表达量与低氧浓度及时间有关。

大脑皮质细胞低氧条件液对神经干细胞增殖的影响及其信号转导通路的分析

目的观察和分析大脑皮质细胞低氧条件液对神经干细胞增殖的影响,并探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)两条信号通路在此过程中的作用。方法原代培养出生后24 h内SD大鼠大脑皮质细胞5 d后,全量换液并在4%O2、1%O2和常氧环境下继续培养细胞6 h以制备低氧条件液和常氧条件液。分别用3种条件液及结合使用PI3-K、JNK信号通路抑制剂LY294002和SP600125悬浮培养神经干细胞,并用免疫荧光染色鉴定神经干细胞,使用增殖效率(神经球数量)和增殖速度(神经球直径)分析神经干细胞的增殖情况。结果 (1)4%低氧条件液组和常氧条件液组神经干细胞的增殖效率高于1%低氧条件液组(P<0.01),但前两者之间差异无统计学意义;(2)与常氧条件液相比,两个低氧条件液均提高了神经干细胞的增殖速度(P<0.01),且4%低氧条件液组神经干细胞的增殖速度较1%低氧条件液组快(P<0.01);(3)在4%低氧条件液中使用LY294002和SP600125同时抑制了神经干细胞的增殖效率和增殖速度,且LY294002抑制作用在24 h之后尤为明显。结论4%大脑皮质细胞低氧条件液能提高神经干细胞的增殖速度,PI3-K信号通路在此过程中发挥主要作用。

不同频率间歇低氧对3T3-L1脂肪细胞炎症因子和脂肪因子的影响

目的：测定不同频率间歇低氧处理的脂肪细胞上清液中肿瘤坏死因子（TNF）－α、白细胞介素（IL）-6和瘦素、脂联素水平的变化。方法：以分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象，随机分为8组，即4个不同频率间歇低氧组（IH1-4处理方案为分别循环充入1．5％0：45s和21％022min15s、4min15s、5min45s和8min45s，每组60个循环）和各自的正常氧对照组（SC1-4，分别给予相应时间的21％O2处理）。完成暴露后收集培养基，采用酶联免疫吸附（ELI—SA）法测定脂肪细胞上清液中TNF—α、IL-6、瘦素和脂联素的水平。结果：各间歇低氧组脂肪细胞上清液内TNF-α、IL-6和瘦素的水平均明显高于各自的正常氧对照组（P〈0．05或P〈0．01），且IH，组显著高于其余IH组（P〈0．05或P〈0．01）；各间歇低氧组脂肪细胞上清液内脂联素的水平均明显低于各自的正常氧对照组（P〈0．01），且IH3组显著低于其余IH组（P〈0．05或P〈0．01）。结论：间歇低氧可以导致体外培养的脂肪细胞TNF-α、IL-6、瘦素和脂联素的分泌异常，脂肪细胞的内分泌功能紊乱可能参与了阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者的胰岛素抵抗的发生。

绞股蓝总黄酮对低氧/复氧心肌细胞Ca^(2+)及NOS-NO系统的作用

目的:探讨绞股蓝总黄酮对培养心肌细胞低氧/复氧损伤的Ca2+超载、一氧化氮合酶一氧化氮(NOS-NO)系统的影响。方法:培养心肌细胞,建立低氧/复氧损伤模型;荧光分光光度法测定心肌细胞内Ca2+,比色法测心肌细胞培养上清液NO含量、细胞匀浆NOS活性。结果:绞股蓝总黄酮降低低氧/复氧心肌细胞内Ca2+、T-NOSi、NOS活性,升高NO含量。结论:绞股蓝总黄酮可抑制低氧/复氧损伤时心肌细胞Ca2+超载及NOS-NO系统的激活。

低氧通过HIF-1α调控髓核细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达

目的观察低氧环境及低氧诱导因子1α(HIF-1α)对髓核细胞中解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-4和ADAMTS-5启动子活性的影响,探讨可能影响椎间盘退变的分子机制。方法将体外培养的大鼠髓核细胞分别置于常氧和低氧(1%O2)培养箱培养,采用蛋白质印迹分析及PCR方法检测细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达。对获取的ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子片段测序,并使用JASPAR数据库分析其中是否存在HIF-1α的结合位点。将HIF-1α过表达质粒、PGL3-ADAMTS-4质粒和PGL3-ADAMTS-5质粒转染至大鼠髓核细胞中,用双荧光素酶报告基因检测系统检测髓核细胞中HIF-1α对ADAMTS-4和ADAMTS-5基因启动子的调控作用。结果蛋白质印迹分析和PCR结果显示,低氧分别在蛋白质水平和m RNA水平抑制髓核细胞中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达。使用JASPAR软件分析后,发现ADAMTS-4启动子中可能包含1个HIF-1α的结合位点,而ADAMTS-5启动子中可能包含2个HIF-1α的结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示,HIF-1α的过表达能够显著抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子活性。结论低氧可能通过HIF-1α抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达,保持椎间盘内环境的稳态,延缓椎间盘退变的发生。

低氧对体外培养小鼠星形胶质细胞超微结构的影响

目的 探讨低氧后体外培养星形胶质细胞超微结构的变化。 方法 通过胶原酶消化、尼龙网过筛、差速粘附等技术对新生小鼠星形胶质细胞进行体外培养 ,待细胞铺满瓶底时 ,在培养液表面覆以液体石蜡形成低氧环境 ,常规培养作为对照 ,电镜下观察细胞超微结构的变化。 结果 正常星形胶质细胞线粒体丰富 ,可见少量高尔基复合体和粗面内质网。低氧星形胶质细胞表面伸出许多微绒毛样突起 ,线粒体肿胀 ,大量溶酶体形成。

低氧对人肺腺癌细胞SPCA-1低氧诱导因子-1α和低氧诱导因子-2α的差异性调控作用

目的探讨低氧对肺腺癌细胞SPCA-1低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和低氧诱导因子-2α(HIF-2α)的差异性调控作用及其原因。方法体外培养肺腺癌细胞系SPCA-1细胞在常氧、低氧条件下培养不同时间,采用RT-PCR和Western blot检测低氧对HIF-2α和HIF-lα基因的激活作用。通过加入线粒体活性氧族阻断剂观察低氧对HIF-2α和HIF-lα蛋白表达的影响,探讨其表达调控的机制。结果正常氧条件下,SPCA-1整细胞提取物和细胞核提取物中,HIF-1α几乎不表达,HIF-2α在整细胞提取物中有少量表达,但在细胞核提取物中无明显表达。经低氧(0.5%O2)处理4 h后,HIF-2α和HIF-1α蛋白均明显增多;HIF-2α和HIF-1α蛋白与细胞浓度、氧浓度有关;HIF-1α蛋白在低氧4 h后增加,6 h后显著降低,而HIF-2α蛋白低氧4 h增加后并保持于此水平。HIF-1αmRNA水平在低氧6～12 h时降低,而HIF-2αmRNA表达持续升高;经线粒体活性氧族阻断剂鱼藤酮、二亚苯基碘鎓和粘噻唑菌醇处理4 h后,HIF-2α和HIF-lα蛋白水平明显降低。结论低氧可在肺腺癌细胞诱导HIF-1α和HIF-2α基因表达;HIF-2α与HIF-1α的mRNA和蛋白水平在细胞低氧适应反应的不同时段有所不同,翻译后修饰在低氧对HIF-1α和HIF-2α的诱导中发挥重要作用;低氧很可能是通过相同的信号通路发挥对HIF-2α和HIF-1α的诱导调控作用。

低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡

背景:骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低,而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖,促进其存活。目的:探讨Pim-1激酶是否介导缺氧预处理对骨髓间充质干细胞的保护作用及其机制。方法:设置不同低氧处理时间(0,6,12,24 h)处理骨髓间充质干细胞,RT-qP CR及Western blot检测Pim-1及凋亡相关基因的表达,确定最佳低氧处理时间为12 h。将骨髓间充质干细胞分为3组:正常对照组、低氧组、低氧+Pim-1抑制剂组,分别进行Transwell迁移实验、细胞凋亡流式检测、线粒体膜电位检测评估各组骨髓间充质干细胞的迁移能力及抗凋亡能力;建立心肌梗死模型,1周后按分组在大鼠梗死心肌周围多点注射骨髓间充质干细胞,2周后制备心肌冰冻切片行DiI染色统计骨髓间充质干细胞存活数量;心肌梗死模型建立前后、细胞移植4周行超声心动图检查评估大鼠心脏功能。结果与结论:(1)低氧处理12 h时,骨髓间充质干细胞的Pim-1、p-Akt及Bcl-2表达量明显升高,Bax、Caspase-3表达量明显降低。(2)低氧组骨髓间充质干细胞抗凋亡能力明显增强,与正常对照组之间差异有显著性意义(P<0.01)。(3)低氧组骨髓间充质干细胞移植1周后存活率明显提高(P<0.001);移植4周后,大鼠心功能明显改善(P<0.05)。上述获益可被Pim-1抑制剂抑制。(4)结果证实,低氧预处理骨髓间充质干细胞通过激活Akt及上调Pim-1表达抑制细胞凋亡,改善骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病的治疗效果。

低氧对大鼠骨髓间充质干细胞HIF-1α表达影响的研究

目的通过体外不同氧浓度下培养大鼠骨髓间充质干细胞,RT-PCR方法检测,观察正常氧浓度和低氧浓度对HIF-1α(缺氧诱导因子-1α)表达的影响。方法分离雄性Wistar大鼠骨髓间充质干细胞体外培养,鉴定其CD34、CD44的表达,分为正常氧浓度组和低氧浓度组培养24h,RT-PCR方法检测,不同氧浓度对细胞HIF-1α表达的影响。结果贴壁法培养的细胞表达CD44,不表达CD34;正常氧浓度培养的细胞较少有HIF-1α的表达,低氧浓度培养的细胞HIF-1α的表达明显增加。结论细胞低氧可激活HIF-1α的表达,低氧浓度培养的细胞的HIF-1α表达较正常氧浓度培养的细胞的表达明显增加。