气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达

【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。

海洋细菌Pseudoalteromonas sp．G23产低温淀粉酶发酵条件的研究

从江苏连云港海域筛选和分离到1株产低温淀粉酶的海洋细菌Pseudoalteromonas sp.G23,对该菌株进行了产α-淀粉酶发酵条件研究,结果表明,该菌株发酵16h后到达产酶高峰,最适产酶温度为15℃,最适产酶pH值为8.5,装液量为20%。可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨促进产酶。利用响应面方法对菌株Pseudoalteromonas sp.G23产α-淀粉酶的发酵条件进行了优化,结果表明,可溶性淀粉浓度为1.16%、蛋白胨浓度为2.11%,发酵温度12.38℃,酶活为41.4U/mL,较优化前提高了7倍。

低温淀粉酶发酵动力学模型的研究

本实验分别利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程描述低温淀粉酶产生菌LA7的发酵过程,建立菌体生长、低温淀粉酶生成和底物消耗的动力学模型,对模型预测值与实验值进行比较。结果表明,模型能较好地拟合发酵过程,具有良好的适用性。

响应面法优化低温淀粉酶发酵条件研究

目的:利用利用响应面法对低温淀粉酶发酵条件进行优化,确定最佳产酶条件。方法:使用Design Expert软件的Plack-ett-Burman设计法对低温淀粉酶发酵条件进行了筛选,并利用响应面分析法进行了主要影响因素进行了回归分析。结果:筛出3个影响较大的因素,即蔗糖、蛋白胨、装添量;得到了各因素的最佳水平值,即蔗糖1.08%、蛋白胨2.02%、装添量87ml。结论:经3批发酵验证,其实验平均值38.1U/ml与预测值38.5U/ml非常接近,相关系数为98.8%。

低温淀粉酶高产菌株的诱变选育

以一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A-4为出发菌株,采用紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变,以期筛选出高产低温淀粉酶量诱变菌株;经紫外线诱变、亚硝基胍诱变、紫外线-亚硝基胍复合诱变,所得突变菌株经淀粉酶平板水解圈初筛、再经摇瓶发酵复筛,得高产低温淀粉酶突变株UNA4-6,其最大产酶量62.13U/mL,是出发菌株A-4的1.96倍;将UNA4-6连续传代6次,低温淀粉酶活性仍可达到第一代的99.7%,试验表明遗传稳定性好。

低温淀粉酶的耐温性研究

采用体外模拟消化方法，研究低温α-淀粉酶经不同温度（60～90℃）处理后对玉米淀粉的作用效果。试验结果表明，随处理温度升高，低温α-淀粉酶对玉米淀粉作用后还原糖释放量和能量的改善程度逐渐降低；但高温处理对低温淀粉酶活性的影响较小，80℃处理后酶活存留率仍可保持在80％以上，调质温度为80℃以下时酶活存留率可保持90％以上。

气单胞菌低温淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

【目的】获得低温菌LA77的低温淀粉酶基因及其生物学信息。【方法】用16S r DNA序列分析对其进行了分子鉴定,并根据分类地位进行了特异引物设计和PCR扩增,通过生物学网站和软件对获得的基因及编码蛋白进行分析。【结果】低温菌LA77归属于气单胞菌属,PCR扩增获得一条编码703个氨基酸的完整开放阅读框的基因。通过生物信息学分析显示该蛋白质理论分子量约为77.9 k D,等电点为6.16,为亲水、且具有信号肽的跨膜蛋白。可能存在10个磷酸化位点,1个糖基化位点,二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成。基于氨基酸序列的结构域和系统进化树分析表明,该蛋白属于α-淀粉酶家族,极可能为低温淀粉酶。【结论】LA77低温淀粉酶基因的获得,将为低温淀粉酶基因的进一步改造、表达以及其酶低温催化机理的阐释奠定重要的基础。

产低温淀粉酶海洋细菌HYM-7发酵条件研究

采用平板初筛和摇瓶复筛等方法,从秦皇岛渤海海域的海水样品中,分离获得产淀粉酶活力较高的菌株HYM-7,初步鉴定为解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus.amylolyticus),设计单因素和正交实验,确定该菌的最佳发酵条件。结果表明:在装液量50mL液体培养基的250mL三角瓶中,采用单因素实验得最佳接种量为1%,最适产酶时间为48h,最适碳源为玉米淀粉,氮源为大豆粉,Ca2+和Mg2+可显著提高产酶量;采用正交实验得最适发酵培养基配方(g/L):玉米淀粉4、大豆粉10、可溶性淀粉2、MgSO40.2、CaCl20.4。对优化的发酵培养基进行验证,测得酶活力为34.62U·mL-1,较基础培养基酶活提高60.8%。

腊样芽孢杆菌低温淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

从废弃的淀粉堆中筛选到一株产低温淀粉酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GXBC-1,通过同源保守序列比对,从中克隆到一个淀粉酶基因。该基因全长为1 764 bp,编码588个氨基酸,分子量约为64kD。将基因克隆到大肠杆菌进行表达及酶学性质研究,该重组酶最适温度为35℃,在20℃仍具有53%的活力;最适pH值为7.0,Km值为0.72 mg/mL。产物经HPLC分析,该酶没有内切酶活性,具有典型的β-淀粉酶特性。

新疆冰川冰缘冻土低温淀粉酶部菌株分子生物学鉴定及酶学特性研究

【目的】对新疆冰川冰缘地区冻土中筛选出的具有良好产低温淀粉酶能力的菌株进行分子生物学鉴定,分析其酶学特性。【方法】用种子培养液活化菌株提取基因组DNA进行PCR扩增,将扩增成功菌株的PCR产物测序结果通过NCBI数据库比对,对冻土中产低温淀粉酶菌株的16S rDNA序列用MegAlign Fasta软件进行系统发育分析。利用Yoo改良法测低温淀粉酶酶活力。【结果】菌株A-2,A-3,A-4经16S rDNA序列分析获得的序列与数据库中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535 16S ribosomal RNA,partial sequence(NR 04145))比对相似率达到99%。该菌株产生的低温淀粉酶的最适作用温度为30℃,最适pH为6。【结论】菌株A-2,A-3,A-4均属解淀粉芽孢杆菌。

低温淀粉酶对保育仔猪生产性能的影响

为研究低温淀粉酶对保育仔猪生产性能的影响,试验选取28日龄断奶仔猪128头,采取同窝分组的方式随机分成2组,即对照组与试验组,每组8个重复,每个重复8头,直至仔猪68日龄试验结束。试验期间,试验组日粮在对照组基础上添加低温淀粉酶500 g/t,两组饲养管理条件完全相同,于断奶后15、40 d分别个体称重,记录每组耗料情况,统计试验期间日增重及料重比。结果表明:断奶至断奶后15 d,试验组日增重179.78 g,比对照组提高33.47%;试验期间全程日增重试验组比对照组高56.15 g,差异极显著(P<0.01)。试验期间,试验组料肉比比对照组降低4.02%;按目前饲料及猪肉价格测算,试验组头平均净增收入比对照组高20.63元。

低温淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从新疆高海拔地区采集土样中定向筛选得到1株低温淀粉酶产生菌株LA77,初步鉴定为解淀粉类芽孢杆菌(P.amylolyticus)。摇瓶发酵实验表明,该菌株最适产酶温度为35℃,最佳产酶pH值为6.0,生长高峰出现在第30h,产酶高峰出现在38h,低温淀粉酶的活力达到34.5U/mL,温度超过40℃时此酶极易失活。此菌株生长周期短,产生的淀粉酶在温度高于40℃极易失活,在化工和食品等行业有良好的应用前景。

高黎贡山土壤低温淀粉酶产生菌的筛选

为获取工业生产上有潜在应用价值的低温淀粉酶产生菌,从高黎贡山百花岭南斋公房采集的土样中定向筛选得到10株产淀粉酶菌株,选择其中透明圈有效值最大的GD-6菌株进行摇瓶发酵。结果表明,该菌株最适产酶温度为20℃,最佳产酶pH为7.0,160 r/min摇瓶培养24 h后,产酶活性为420.9IU/(mL·min)。

日粮中添加低温淀粉酶对仔猪生长性能的影响

试验旨在研究一种新型的低温淀粉酶对仔猪生长性能的影响。选用28日龄胎次、体重接近的健康仔猪200头(公母各半),采用随机分组方式分成试验组和对照组,每组4个重复,每个重复25头仔猪,试验期20 d。试验期间,试验组日粮在对照组日粮基础上添加低温淀粉酶500 g/t。结果表明,试验组仔猪平均净增重比对照组高590 g,提高了9.91%(P>0.05);平均日增重比对照组高30 g,提高了10.07%(P>0.05);料肉比比对照组降低0.14,降低了8.75%。经济效益分析表明,日粮中添加低温淀粉酶饲养20 d试验组比对照组多盈利7.83元/头。

添加低温淀粉酶对AA肉鸡生产性能的影响

为了探讨日粮中添加低温淀粉酶对A A鸡生产性能的影响,试验选取1日龄健康的AA肉鸡600羽,随机分成2个处理组,每个处理组3个重复,每个重复100只。试验分为对照组(基础日粮)和试验组(基础日粮+300g/t低温淀粉酶),试验期42d。结果表明:试验组肉鸡比对照组平均净增重高103.60g,提高了3.94%(P<0.05);平均日增重比对照组高2.47g,提高了3.95%(P<0.05);料肉比比对照组低0.09,降低了5.14%;成活率比对照组提高了3.16%。经济效益分析表明,日粮中添加低温淀粉酶饲养42d试验组比对照组多盈利1.18元/只。以上结果说明,在日粮中添加低温淀粉酶能提高A A肉鸡的生产性能。

天山1号冰川底部沉积层产低温淀粉酶菌株的系统发育及其酶学性质初步研究

从天山一号冰川底部沉积层的含冰沉积层中筛选出8株产低温淀粉酶的菌株，其中3株菌M12—1、X2、LIO-1的产酶性能较强。根据形态特征、生理生化特性，以及16SrRNA基因序列的系统发育分析，8株菌隶属于4个系统发育类群，产酶较强的菌株M12—1、x2归属于Paenibacillus polymyxa，菌株LIO—1隶属于Hymenobacter spp．。所有菌株的最适生长温度在20—25℃，为兼性耐冷细菌。发酵复筛实验表明菌株L10—1的产酶性能最高，粗酶液发酵酶活达到86．8U／mL，所产淀粉酶的最适温度均在35℃，最适作用pH为6．0，在40℃以上温度处理后酶活性显著下降。热稳定性较差，属于典型的金属激活酶。本研究为高山冰冻圈环境产适低温淀粉酶菌种资源的开发及低温淀粉酶在食品工业领域的应用提供了理论依据。

南极磷虾产低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

从冷冻南极磷虾虾肉中筛选出1株高产低温淀粉酶的菌株,研究其酶学性质,以提高酶的热稳定性。通过菌株的形态特征、生理生化鉴定和16S rRNA序列比对,确定其为乳酸假单胞菌(Pseudomonas lactis),命名为Pseudomonas lactis A5-2。酶学性质表明,该酶的最适反应温度为20℃,最适反应pH为6.0,属于典型的弱酸性低温淀粉酶。Fe ^3+、Cu ^2+和Mn ^2+对酶有不同程度的抑制作用,K^+、Mg ^2+、Ca ^2+和Na+对酶有不同程度的激活作用,其中Cu ^2+对酶的抑制作用最强,Na+对酶的激活效果最强。在酶的反应体系中同时加入Na^+和Ca^ 2+后,酶的半衰期从20 min延长至80 min,是不加金属离子的4倍,有效地提高了酶的热稳定性。

海洋低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

以大连黄海海泥和海水为样品,采用稀释涂布平板透明圈法初筛、摇瓶发酵复筛,得到一株淀粉酶高产菌ZXS-5,测得酶活为6.25 U/mL。通过形态学、生理生化及16S rDNA序列鉴定,菌株ZXS-5为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。该酶的最适作用温度为25℃,酶的热稳定性相对较差;最适作用pH值为8.0,属于碱性酶,该酶在酸性条件下稳定性较差;Ba^(2+)、Cu^(2+)、乙二胺四乙酸(EDTA)对该酶抑制性较强,Fe^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)对该酶的活性影响不明显,Mg^(2+)、Na^+对该酶激活作用较弱,Ca^(2+)对该酶激活作用较强。

添加低温淀粉酶对断奶仔猪生产性能的影响

试验旨在研究一种新型的低温淀粉酶对断奶仔猪生产性能的影响。选用28日龄胎次、体重接近的健康仔猪200头（公母各半），采用随机分组方式分成试验组和对照组，每组4个重复，每个重复25头仔猪，试验期20d。试验期间，试验组日粮在对照组日粮基础上添加低温淀粉酶500g,／t。结果表明，试验组仔猪平均净增重比对照组高59％，提高了9．91％（P〉0．05）；平均日增重比对照组高30g，提高了10．07％（P〉0．05）；料肉比比对照组降低0．14，降低了8．75％。经济效益分析表明，日粮中添加低温淀粉酶饲养20天试验组比对照组多盈利7．83元／头。

低温淀粉酶菌株分离及其酶学性质研究

通过淀粉底物平板从南极土壤中分离筛选出一株产淀粉酶的菌株,通过16S rDNA鉴定为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)菌株.酶学性质表征发现该酶的最适温度为20℃,最适pH为9.0.摇瓶发酵2 d,酶的比酶活为15.7 U/mg.Ca^(2+)和Mg^(2+)对其有激活作用,而Hg^(2+)和Ni^(2+)是该酶的强力抑制剂.同时,该酶不但可以水解直链淀粉,还可以水解支链淀粉,表现出较宽泛的底物选择性.以上结果表明Arthrobacter oxydans产生的淀粉酶符合低温淀粉酶的特性,在食品上有一定的应用前景.