一种新的低温玻璃化破碎技术

提取细胞中的营养成份具有重要意义。基于低温玻璃化保存过程中的低温断裂现象 ,对目前常用细胞破碎技术进行了综述 ,在阐明其优缺点的基础上 ,提出了一种新的细胞破碎方法。通过比较分析 ,指出了该方法的可行性和优越性。

低温玻璃化保存理论在水产品贮藏中的应用

一、引言 低温保存是食品的最佳保存方法之一,但食品原料在冷加工、贮藏和运输过程中质量的下降仍无法避免。早在本世纪40年代起,食品科学家和工程师们就如何提高冻结食品的质量进行了不懈的努力,做过大量的研究,其中最有代表性的成果是T.T.T.概念的提出。80年代初,随着食品聚合物理论的提出,食品的低温保存研究进入了一个新纪元,到90年代就有1000多篇相关论文发表,而国内这方面的研究刚刚起步。

玻璃化超低温保存对独占春原球茎生理生化特性影响

为探明兰花稀缺品种独占春(Cymbidium eburneum Lindl.)玻璃化超低温保存技术中成活率较低的问题,以独占春原球茎为研究对象,研究了玻璃化超低温保存技术对其生理生化特性的影响,并分析了各生理指标之间的相互关系。结果表明:逆境胁迫中,含水量随玻璃化超低温保存进程缓慢降低,卸载处理迅速降低,其含水量是对照处理的79.06%;相对电导率逐渐升高,卸载处理达到最高(86.36%);氧化损伤指标中的丙二醛(MDA)质量摩尔浓度显著升高,玻璃化处理达到最大;蛋白质羰基(PCO)质量摩尔浓度则是先升高后降低再升高,玻璃化处理质量摩尔浓度最低;氧化物质指标中的过氧化氢酶(CAT)活性和抗坏血酸(ASA)质量摩尔浓度变化趋势一致,均先升高后降低,且预培养处理达最大值;超氧化物歧化酶(SOD)活性先降低后升高,呈现双峰变化趋势;活性氧成分中H_(2)O_(2)和·OH质量摩尔浓度在玻璃化处理均达到最大值,且H_(2)O_(2)质量摩尔浓度变化趋势和CAT活性变化趋势在玻璃化超低温保存进程中表现为相互抑制。通过相关性分析,CAT活性和超氧自由基(O·-2)质量摩尔浓度呈极显著正相关,和H_(2)O_(2)质量摩尔浓度呈显著负相关,表明氧化酶物质对活性氧成分具有清除作用。

衣藻细胞玻璃化超低温保存技术的研究

本研究以衣藻为材料,探讨其玻璃化超低温保存的条件和方法,结果表明,衣藻经含0.25mol/L蔗糖溶液的TAP培养基预培养一天后,在玻璃化冷冻保护剂中脱水5分钟,直接投入液氮,48小时后快速化冻,去保护剂并用含0.5mol/L蔗糖溶液的TAP培养基暗培养一天,再转到TAP培养基暗培养一天,最后置光照条件下恢复培养,其存活率可达31.45％,恢复培养后衣藻细胞的生长规律与未冻存的衣藻相一致。

花烛胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存条件研究

为建立适宜的花烛（Anthurium andraeanum Lind.）胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存技术,采用单因素实验方法对影响玻璃化超低温保存后细胞相对存活率的主要因素进行了研究。结果表明,经玻璃化超低温保存后花烛悬浮细胞的相对存活率与悬浮细胞的继代培养时间、渗透调节剂的种类和浓度及预培养时间、装载液种类和预处理时间、PVS2脱水时间以及超低温保存后的化冻温度均有一定的关系。继代培养3和5 d,细胞的相对存活率较高（约20%）;分别以0.3、0.5、0.7 mol·L^-1山梨醇和60、80、100、120 g·L^-1蔗糖为渗透调节剂预培养0-4 d,以0.5 mol·L^-1山梨醇预培养2 d的效果最好,细胞的相对存活率为26.2%;用体积分数25%PVS2预处理15 min,细胞的相对存活率最高（29.0%）;分别用体积分数100%PVS2脱水0、5、10、15、20、25和30 min,其中脱水10 min的悬浮细胞相对存活率最高（32.1%）;分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃水浴条件下进行化冻处理,其中用40℃水浴化冻的悬浮细胞相对存活率最高（32.1%）。花烛胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存和化冻的适宜流程为：将继代培养3-5 d的胚性悬浮细胞团（直径2 mm）在含0.5 mol·L^-1山梨醇的1/2MS液体培养基中预培养2 d后,于4℃条件下处理24 h,然后先用体积分数25%PVS2室温预处理15 min,再用体积分数100%PVS2在0℃条件下脱水10 min,最后迅速投入液氮中冷冻保存;将经过冷冻保存的细胞置于40℃水浴中化冻3 min,用含1.2mol·L^-1蔗糖的1/2MS液体培养基洗涤3次（每次10 min）,之后即可进行恢复培养。

百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析

采用单因素随机区组试验及多因素、多水平正交试验方案建立了百子莲胚性愈伤组织(embryogenic callus,ECs)玻璃化法超低温保存体系。将由花梗诱导的胚性愈伤组织接种至预培养基(MS+0.5mol/L蔗糖+1%琼脂)上,在4℃下预培养2d后,在室温下加入装载液(MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L丙三醇+10mmol/L KNO3)处理60min;利用改良后的PVS 2玻璃化溶液(MS+0.4mol/L蔗糖+30%丙三醇+15%乙二醇+15%DMSO)在0℃下处理40min,将含有ECs的冻存管投入液氮中冻存1h;在40℃水浴中快速解冻90s;用洗涤液(MS+1.2mol/L蔗糖+10mmol/L KNO3)处理30min,每10min换1次新鲜的洗涤液;洗涤后,接种到胚性愈伤组织增殖培养基上恢复培养24h后,相对成活率分别达56.9%(TTC法)和43.3%(Evans blue法)。恢复培养55d的百子莲胚性愈伤组织经过AFLP多态性检测后未发现基因组变异,证明该方法可用于百子莲种质资源的超低温保存。

肌腱细胞与聚二甲基硅氧烷多孔材料复合培养后的玻璃化低温保存

背景:大量实验已证明,玻璃化低温保存能获得更高的细胞存活率。目的:观察玻璃化低温保存对肌腱细胞与聚二甲基硅氧烷材料复合物的影响。方法:取共培养9-14 d的肌腱细胞-聚二甲基硅氧烷复合物,分别以10%二甲亚砜、玻璃化低温保存液VS55、21%二甲亚砜进行低温保存和复苏。复苏培养1 h后,进行死/活双色荧光染色和流式细胞技术分析,观察肌腱细胞存活率,以新鲜培养的肌腱细胞-聚二甲基硅氧烷复合物为对照。结果与结论:1死/活双色荧光染色:10%二甲亚砜组肌腱细胞从聚二甲基硅氧烷支架材料孔隙表面上剥脱,呈双染的不规则细胞形态;VS55组和21%二甲亚砜组存在单染绿色荧光的梭形和球形细胞,也存在红绿双染的不规则形态细胞,两组细胞观测密度较对照组明显下降;2流式细胞技术分析:对照组细胞大小均匀;10%二甲亚砜组由于细胞量少而不足以进行流式细胞检测;VS55组以较小体积的细胞颗粒为主;21%二甲亚砜组细胞体积大小与新鲜对照组类似,同时存在较小颗粒;3细胞回收率与存活率:VS55组细胞相对存活率低于21%二甲亚砜组(64.9%,76.2%,P<0.05);10%二甲亚砜不能获取足够细胞,未能行细胞计数;4结果表明:采用21%二甲亚砜玻璃化低温保存有利于提高细胞的存活率,保持肌腱细胞-支架结合完整。

玻璃化深低温法与去细胞光氧化技术制备同种异体小动脉体内性能比较

目的:通过兔异体颈动脉旁路移植模型,对玻璃化深低温及去细胞光氧化交联处理的兔颈动脉进行体内性能比较,评价两种血管作为临床异体小血管替代物的可行性。方法:将36只SPF级纯种兔随机分成两组,分别予以玻璃化深低温处理的兔颈动脉及去细胞光氧化处理的兔颈动脉行异体颈动脉移植。实验动物分别饲养观察1周、2周和4周后,观察移植血管的通畅情况及内膜增生情况。结果:超声检查发现术后4周去细胞光氧化组的累计通畅率显著高于玻璃化深低温组(P<0.05)。HE染色显示玻璃化深低温组术后免疫反应表现比较严重。去细胞光氧化组术后内皮细胞则生长良好,炎性细胞浸润少。Ⅷ因子染色显示,术后4周玻璃化深低温处理组内皮细胞有不同程度的破坏;而去细胞结合光氧化组内皮生长良好。通过图像分析发现,移植后1周两组血管内/中膜比差异无统计秀而意义(P>0.05),术后2周及4周内膜两组血管内/中膜比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:体内性能方面,去细胞光氧化技术制备同种异体小动脉生物稳定性、抗血栓性及内膜增生情况均要优于玻璃化深低温处理的异体兔颈动脉,但同样也存在瘤样扩张,内膜增生等不足。

食品玻璃化保存的研究进展及存在的问题

食品的低温玻璃化保存是近十年发展起来的一门新学科。对食品玻璃化保存的研究现状做了简单的介绍，分析了 Ｗ Ｌ Ｆ和 Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ关系式在应用于食品体系生化反应方面存在的问题， 探讨了在食品部分玻璃化保存下 Ｔ Ｔ Ｔ概念和酶的稳定性，

玻璃化超低温对红肉脐橙愈伤组织存活率的影响

本研究探讨了玻璃化超低温处理对红肉脐橙愈伤组织存活率的影响。

高山红景天愈伤组织的玻璃化法保存及植株再生

采用玻璃化法对高山红景天的愈伤组织进行了超低温保存研究.高山红景天愈伤组织在8%蔗糖中暗培养5 d后,先用25℃的60%玻璃化保护剂PVS2预处理20 min,转至100%PVS2于-20℃乙醇浴中处理2 h后,投入液氮进行保存,48 h后使用40℃水浴快速化冻.冻存后的愈伤组织用液体培养基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+40%蔗糖洗涤3次,再转入MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5 mg/L固体培养基中在22℃条件下进行暗培养,2周后转入光照培养(光照强度800 lx).6周后观察到高山红景天愈伤组织呈鲜绿色,长势较为旺盛,存活率可达到78.24%.冻存后的愈伤组织可诱导成苗.

马铃薯茎尖超低温保存流程TTC活力响应

以马铃薯栽培种呼自83-213无菌试管苗茎尖为材料,通过开展2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride)茎尖活力染色关键因素研究,优化了马铃薯茎尖TTC活力染色条件,确定了适合的染色温度为40℃,染色时间为2 h。利用优化的TTC活力染色条件,对马铃薯茎尖小滴玻璃化超低温保存关键步骤处理茎尖进行TTC活力观察。研究发现:经蔗糖预培养(MS培养液添加0.3 mol/L和0.5 mol/L蔗糖)的茎尖与新鲜茎尖均保持高活力;经PVS2处理后茎尖表现时空特异性活力丧失和存活,分生组织和叶原基中间区域仍保持较高活力。通过对茎尖TTC活力染色面积测定,发现当茎尖TTC活力染色面积比≥0.4时,TTC活力染色与恢复培养存活率呈极显著正相关。

大苞鞘石斛原球茎超低温保存中生理生化变化

以继代培养60 d的大苞鞘石斛原球茎(=2～3 mm)为材料,对比研究低温高渗(HT+CA)和室温高渗(HT-CA)2种预处理方法对原球茎玻璃化法超低温保存冷冻前含水量以及预处理、脱水和解冻3个关键步骤中相对电导率、丙二醛质量摩尔浓度、可溶性糖和可溶性蛋白质量分数的影响,并结合显微结构观测和组织化学分析揭示高渗预处理影响超低温保存后原球茎相对存活率的生理生化基础。结果表明:在冷冻前,干样含水量显著降低,当干样含水量下降为1.06 g.g-1时,冻后相对存活率达最大值,为46.6%;预处理和脱水显著地提高了相对电导率;脱水和解冻使丙二醛质量摩尔浓度显著升高;可溶性糖和可溶性蛋白质量分数呈显著上升后明显下降的单峰变化曲线。多元相关分析表明,丙二醛质量摩尔浓度与相对存活率之间呈极显著负相关(相关系数为-0.992),膜脂过氧化作用是影响大苞鞘石斛原球茎冻后成活的关键因素之一。显微结构观察到细胞膜在预处理和脱水过程中受到明显破坏;组织化学分析显示淀粉粒和蛋白质的分布多集中在未受损伤的顶端分生组织中,分布变化呈先增多后减少的趋势,这与生理生化分析的结果是一致的。

香蕉胚性细胞悬浮系玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性分析

采用玻璃化法对3个香蕉栽培品种(Musa spp.AAA)的胚性细胞悬浮系(ECS)进行超低温保存。对超低温保存程序进行优化,冻存后进行ECS重建并通过体细胞胚发生途径进行植株再生,最后对再生植株进行遗传稳定性分析。用建立的ECS玻璃化法超低温保存程序对‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’和‘粤优抗1号’的ECS进行超低温保存,获得的细胞相对存活率分别为89.6%、90.9%和89.9%,并重建了‘北大矮蕉’的ECS;在冻存后体细胞胚发生途径植株再生过程中,3个品种的相对植株再生率分别为64.4%、0.9%和14.0%。从冻存后‘巴西蕉’ECS获得的细胞胚发生途径再生植株的遗传稳定性分析结果表明:再生植株与对照在形态学方面无明显区别;简单序列重复区间(ISSR)分子标记也显示与对照相比基本无差异带出现,这初步表明超低温保存后的香蕉ECS保持了遗传稳定性。

黄芪休眠芽茎尖玻璃化超低温保存研究

目的建立黄芪休眠芽茎尖玻璃化超低温保存技术体系。方法采用单因子实验设计,研究PVS2处理时间、休眠芽大小、冻存茎尖大小以及缺少装载和PVS2处理对黄芪休眠芽玻璃化超低保存成活率的影响。结果将一年生黄芪种苗覆土后置于4℃低温锻炼20d左右,切取完整的休眠芽,剥至1~2 mm长的茎尖,先用含2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖的MS溶液装载20 min,再用PVS2处理50 min后投氮,恢复培养时从液氮中取出,38℃水浴化冻2 min,用无菌滤纸吸干表面溶液后接种到恢复培养基中(MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8),先暗培养一周,再移到正常光照下进行培养,休眠芽冻存后的成活率高达100%。结论建立了高效的黄芪休眠芽玻璃化超低温保存技术体系,为药用植物的种质资源保存开辟了一条新的途径。

党参休眠芽玻璃化超低温保存及植株再生

目的建立党参休眠芽玻璃化超低温保存技术体系。方法采用单因子试验设计对党参休眠芽的预培养、PVS2处理时间及苞片有无、低温锻炼时间等几个关键因素进行研究,以建立党参休眠芽玻璃化超低温保存体系。结果将两年生的新鲜党参覆土后置于4℃低温锻炼90d左右,切取带少量根基和苞片的完整休眠芽,先用2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖溶液装载20min,再用PVS2处理80min后直接投入液氮。恢复培养时从液氮中取出,先用40℃水浴化冻2min,再用含1.2mol/L蔗糖的MS无机盐培养液卸载20min,最后用无菌滤纸吸干芽表面的溶液,接种到恢复生长培养基中(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L),于正常光照下培养,休眠芽冻存后的成活率达到74%。结论建立了党参休眠芽玻璃化超低温保存技术体系,该技术方法可为药用植物种质资源保存开辟一条新途径。

留兰香超低温保存再生植株遗传稳定性研究

目的 探索玻璃化超低温过程中不同预处理和PVS2处理时间两个关键环节对留兰香再生植株遗传稳定性的影响,为植物种质资源超低温保存提供理论依据。方法 使用改良CTAB法提取留兰香超低温再生植株DNA,用16条引物分别对不同预处理和不同PVS2处理后的35株留兰香超低温再生植株DNA进行ISSR-PCR扩增检测。结果 不同浓度蔗糖和预处理时间,共扩增出3465条带,均未检测到变异条带;不同PVS2处理时间,共扩增出条带1776条,也未出现变异条带。形态学指标测定结果表明,超低温保存再生植株的株高、茎粗、主茎叶片数、节间数、叶片色及叶片数均未发生变异。结论 一定范围内高浓度蔗糖预处理和不同PVS2处理时间不会引起超低温保存再生植株产生变异,留兰香的超低温再生植株具有遗传稳定性,玻璃化超低温保存可作为一种留兰香优良种质资源保存的方法。