猪IL-2与IL-6的原核表达及其对伪狂犬病基因缺失疫苗的佐剂效应研究

将猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)的cDNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a及pGEX-KG上,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导产生重组蛋白pIL-2与pIL-6,表达量分别占菌株总蛋白的43.45％和28.37％,经提纯后含量可分别达到97.06％和86.37％。将提纯后不同剂量的两种重组蛋白以单独或组合的方式,加入伪狂犬病(Ea株)TK^-/gG^-双基因缺失疫苗中,使每头份疫苗分别含2、5和10μg·ml^(-1)的pIL-2或(和)pIL-6,用此疫苗免疫伪狂犬病抗体阴性猪。同时设试验对照组。初次免疫30d后加强免疫,测定中和抗体,观察试验猪的日增重情况,进行统计分析。发现各试验组的抗体水平均高于不含重组蛋白的基因缺失疫苗组;其中,含2μg·ml^(-1)pIL-2试验组与含10μg·ml^(-1)pIL-2/pIL-6试验组抗体水平和基因缺失疫苗对照组之间呈显著差异(P=0.019)与极显著差异(P=0.009)。结果表明,大肠杆菌表达的pIL-2、pIL-6对伪狂犬病鄂A株基因缺失疫苗(TK^-/gG^-/LacZ^+)有较强的佐剂效应,且呈剂量相关性。不同试验组日增重比较结果表明,免疫效果高低与猪的生长速度呈正相关。本试验为重组pIL-2与pIL-6作为新型疫苗佐剂应用提供了重要的试验依据。

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应

作者应用含CpG基序序列的重组质粒（即CpG DNA）作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果。结果表明：CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍。CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照 与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照（PD504.69）。在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗（50、200μg.头份-1）都比高剂量组（500μg.头份-1）诱导的抗体滴度高,其中50和200μg.头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14~32 d诱导的抗体滴度高达1∶1500,是标准疫苗的4~5倍,而500μg.头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应。研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔。

CpG DNA重组质粒对猪囊尾蚴抗原的免疫佐剂效应研究

用CpG基序寡核苷酸的重组质粒(CpGDNA)与猪囊尾蚴抗原制备疫苗免疫小鼠,检测小鼠抗囊尾蚴总抗体和IgG2a抗体亚类以及体外诱导免疫脾细胞分泌白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量,观察其免疫佐剂效应。发现CpGDNA重组质粒中无论插入CpG基序多或少都能增强小鼠抗囊尾蚴总抗体和IgG2a抗体亚类含量,都具有免疫佐剂效应,但其免疫强度有差别,其中CpG2的佐剂效应最强;此外,CpGDNA重组质粒能与铝胶、206佐剂配伍发挥免疫增强协同作用。

猪IFN-γ和IL-4重组质粒对口蹄疫疫苗的免疫佐剂效应研究

为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4+/CD8+T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4重组质粒都能显著提高小鼠抗口蹄疫抗体水平(P<0.01),其中pcDNA3.1/IFN-γ提高亚洲Ⅰ型FMD抗体水平的佐剂效应较pcDNA3.1/IL-4的显著(P<0.01),而pcDNA3.1/IL-4提高O型FMD抗体水平的佐剂效应显著高于pcDNA3.1/IFN-γ(P<0.01),pcDNA3.1也显示出了一定的佐剂效应;免疫后不同时间pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4组CD4+/CD8+T细胞比值显著高于其他组(P<0.01),且第21天与第7、45天的差异极显著(P<0.01)。

阳离子PLG纳米颗粒包裹对CpG序列免疫佐剂效应影响的研究

本试验制备了聚乙交酯丙交酯(PLG)纳米颗粒,比较了阳离子PLG纳米颗粒和脂质体作为载体包裹CpG分子对小鼠体液和细胞免疫反应的影响。结果发现,阳离子PLG纳米颗粒包裹CpG能显著提高免疫小鼠总IgG,增加小鼠免疫细胞数量,增强淋巴细胞增殖活性及白细胞介素-2的诱生活性。它同阳离子脂质体作为包裹分子的效应相似或较强,能显著提高裸CpG质粒的免疫增强活性。

细胞因子免疫佐剂效应在疫苗接种中的应用

细胞因子具有明显的免疫佐剂效应，可增强病毒、细菌和寄生虫疫苗的保护效应，激发对肿瘤抗原的免疫反应，临床试用取得初步效果。研究表明，细胞因子佐剂效应的范围广泛，作用机理复杂，本文简要介绍与此有关的研究进展。

大肠杆菌不耐热肠毒素的分子生物学及粘膜免疫佐剂效应

大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-Labile,LT)是由产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)分泌的一种外毒素。LT既有较强的免疫原性又有较强的粘膜佐剂效应,其毒力较霍乱毒素(choleratoxin,CT)小而被认为是替代CT的最有潜力的粘膜免疫佐剂。本文从LT的分子结构、分子生物学特性、免疫原性、粘膜佐剂效应及其作用机制以及LT的粘膜免疫佐剂的应用等方面进行了讨论。

CD_(58)分子在新城疫疫苗免疫中的佐剂效应探讨

应用从猪红细胞提取的 CD58分子协同新城疫 疫苗 ,免疫 18日龄尼克红公鸡 ,以β-微量法测定ND抗体效价。并在免疫后 39d用 F4 8E9强毒株攻毒。结果表明 ,CD58能促进 ND抗体的提前产生 ,使应答负期明显缩短 ,并且试验组 ND抗体效价显著高于对照组 (P<0 .0 5 ,或 P<0 .0 1)。攻毒后 7d内 ,试验组鸡死亡率为 16 .7% ,对照组为 5 3.3%。

草鱼β-防御素1的趋化活性及免疫佐剂效应研究

为了探究草鱼防御素的免疫调节作用,研究通过Clustal Omega多序列比对和I-TASSER二级结构预测,发现草鱼β-防御素1(Ctenopharyngodon idellaβ-defensin 1,CiBD1)是一类具有两亲性的富含半胱氨酸的小分子阳离子肽,其结构在硬骨鱼类中高度保守;通过构建pET-32a-CiBD1原核表达载体,IPTG诱导表达后经过Ni^(2+)亲和层析法纯化和肠激酶酶切获得CiBD1重组蛋白,通过CFU平板法验证了CiBD1的抑菌活性,当蛋白浓度达到200μg/mL时,对革兰氏阴性菌(G+)及革兰氏阳性菌(G–)都具有显著的抑制活性;趋化实验表明CiBD1在50 ng/mL时对草鱼原代白细胞趋化活性最佳;通过个体实验探究了CiBD1重组蛋白对嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫佐剂效应,发现添加CiBD1佐剂组死亡率显著低于单独疫苗组,且该组IgM和MHCⅡ转录水平及血清中补体3(C3)和溶菌酶含量都显著高于对照组。研究表明CiBD1重组蛋白在细菌抗感染免疫中发挥着重要作用,在水产养殖中具有一定的应用前景。

固体脂质纳米粒佐剂效应研究

为了研究固体脂质纳米粒通过表面吸附抗原蛋白所发挥的免疫佐剂效应,试验用热融超声乳化法制备固体脂质纳米粒悬液(SLN1和SLN2),用激光纳米粒度仪对纳米粒进行了平均粒径(mean diameter,MD)、多分散性系数(polydispersity index,PDI)、表面电位(zeta potential,ZP)的检测。以BSA蛋白为标志抗原,将36只ICR雌性小鼠随机分为6组,即BSA溶液组(500μg/mL BSA溶液1 mL)、BSA-SLN1组(BSA-SLN1950μL+10 mg/mL BSA 50μL)、BSA-SLN2组(BSA-SLN2950μL+10 mg/mL BSA 50μL)、BSA-CFA组(1 mg/mL BSA溶液500μL+CFA 500μL)组、空白SLN组(不加BSA的SLN悬液1 mL)和生理盐水阴性对照组(灭菌生理盐水1 mL),各组小鼠通过腿部肌肉注射相应溶液100μL免疫,免疫后2,4,6周采血,采用间接ELISA法检测血清抗体效价。结果表明:制得的固体脂质纳米粒悬液外观呈乳白色、无味、无沉淀。光学显微镜观察大小比较均匀、分散性好。SLN1悬液的MD、PDI、ZP与SLN2悬液相比均差异显著(P<0.05)。BSA-SLN组抗体效价约为14 lb,显著高于BSA溶液组(10 lb,P<0.05),但显著低于BSA-CFA组(18 lb,P<0.05),而空白SLN组与阴性对照组检测结果都为阴性。第6周BSA溶液组抗体效价大幅降低,而BSA-SLN组与BSA-CFA组继续维持原有水平。比较不同粒径的纳米粒佐剂效应结果显示,SLN1[(237±2)nm]与SLN2[(95±5)nm]固体脂质纳米粒具有非常相似的佐剂作用,二者抗体效价无显著差异(P>0.05)。说明SLN能够通过吸附抗原蛋白显著地提高免疫反应,具有良好的佐剂作用。

白细胞介素-2免疫佐剂效应的研究进展

1976年,D.A.Morgan等[1]最先报道,用丝裂原刺激鼠脾淋巴细胞可产生白细胞介素-2（IL-2）。IL-2具有激活杀伤细胞和自然杀伤细胞,刺激T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生细胞因子的能力,在机体的免疫应答中起重要作用。

白细胞介素-2免疫佐剂效应的研究进展

IL-2是由淋巴细胞产生的具有免疫调节作用的细胞因子。近年来,IL-2配合疫苗使用的佐剂效应已经成为免疫学研究的热点。大量研究表明,重组IL-2作为疫苗佐剂,可以提高细菌、病毒和寄生虫等疫苗的免疫效果。本文就国内外关于IL-2免疫佐剂效应的研究现状做一简要综述,便于一线工作人员在制订实验计划时参照。

吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂联合铝佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效应分析

目的探讨吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂INCB024360类似物与铝佐剂联合对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导小鼠体液免疫应答的影响,以评价其复合佐剂效应。方法分别将三种不同剂量的INCB024360类似物(150μg,100μg,50μg)与Al(OH)_3(300μg)复合后与HepA-1共同免疫ICR小鼠分别作为复合佐剂1组,2组,3组,同时设空白对照组、单纯疫苗组、铝佐剂对照组和单一INCB024360类似物(100μg)组,共免疫一次,于免疫后4周、8周、12周、16周进行尾静脉采血,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清抗甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体水平。结果除空白对照组外,各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周,均产生抗HAV IgG抗体,抗体水平随免疫时间的延长逐渐升高,于12周达到峰值。复合佐剂2组[HepA-118 EU+Al(OH)_3 300μg+INCB024360类似物100μg]产生的抗体水平最高且持续时间较长,在8周和12周时,其对HepA-1的免疫增强效应显著高于单一佐剂组以及铝佐剂对照组(P<0.05,t值分别为3.169、2.439)。4周、8周、12周、16周,单一佐剂组与单纯疫苗组差异均不具有统计学意义(P>0.05)。结论 IDO抑制剂INCB024360类似物与铝佐剂复合后具有较强的复合佐剂效应,免疫增强效应优于铝佐剂对照组;但是单一的INCB024360类似物不具有显著佐剂效应。

重组人热休克蛋白70D的免疫佐剂样效应研究

目的 :研究重组人热休克蛋白 70 D(rh HSP70 D)蛋白的免疫佐剂样效应。 方法 :用 rh HSP70 D诱导体外培养的树突状细胞 (DC) ,观察 DC分泌前炎性细胞因子的水平、DC成熟及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力 ;用 rh HSP70 D与OVA2 57- 2 6 4体外交联的蛋白免疫 C5 7BL / 6小鼠 ,观察能否诱导产生抗原特异性免疫保护作用。结果 :rh HSP70 D可以明显刺激DC分泌 IL- 1β、IL- 12 p70、TNF- α等细胞因子 ,可以促进 DC表达 HL A- DR、CD86、CD4 0等膜分子 ,增强 DC诱导同种异体 T淋巴细胞增殖的能力 ;rh HSP70 D- OVA2 57- 2 6 4交联蛋白可诱导小鼠产生具有明显抗原特异性的免疫保护作用 ,而 rh HSP70 D或OVA2 57- 2 6 4单独免疫小鼠均不能产生这种保护作用。 结论 :rh HSP70 D能通过促进 DC成熟、刺激前炎性细胞因子的分泌增强DC的免疫激发功能 ,rh HSP70 D-抗原肽复合物免疫能够诱导产生抗原特异性的免疫保护作用 ,提示 rh HSP70 D有望作为一种新的佐剂应用于抗肿瘤及抗感染免疫治疗。

Toll样受体介导mRNA疫苗自佐剂效应的研究进展

随着辉瑞/BioNTech和Moderna公司的mRNA疫苗获批上市,mRNA疫苗技术再次引起关注。作为一种新型疫苗,mRNA疫苗在承接DNA疫苗、病毒载体疫苗精准设计、快速制备等优势的同时,还具备较高的生物安全性,在预防传染病及抗肿瘤方面均具有广阔的应用前景。但mRNA疫苗的自佐剂效应作为影响免疫效力的重要因素,其作用备受争议。本文主要就机体内Toll样受体(Toll like receptor,TLR)对mRNA疫苗的识别应答方式,Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-1)及干扰素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)应答表现出的自佐剂效应复杂性,以及在mRNA修饰及结构上调控该种效应的策略作一综述。

沙门菌鞭毛蛋白免疫佐剂效应关键位点的研究

为了研究沙门菌鞭毛蛋白发挥免疫佐剂效应的关键位点,获得新型高效的蛋白免疫佐剂,从实验室保藏的质粒中通过双酶切方法获得了分别编码野生沙门菌鞭毛蛋白、D1保守区N端第88-96位氨基酸突变鞭毛蛋白、D1保守区C端第411位丙氨酸突变鞭毛蛋白、高变区第183-279位缺失鞭毛蛋白SJW61的目的基因,连接入原核表达质粒pET30a＋,并转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达;SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白;分别以4种鞭毛蛋白混合卵清白蛋白（OVA）免疫C57BL/6小鼠,二免后收集血清ELISA检测OVA蛋白特异性抗体效价;取脾脏细胞ELISPOT法检测特异性IFN-γ及IL-4分泌细胞。结果显示：4种原核表达的鞭毛蛋白均以胞内可溶形式表达;Western blot分析显示,4种蛋白均具有良好的免疫原性;动物结果表明,4种原核表达的鞭毛蛋白及其突变体均能显著增强OVA蛋白的特异性免疫应答（P〈0.05）,且免疫应答趋向于Th2型（P〈0.05）,其中D1保守区N端第88-96位氨基酸突变鞭毛蛋白佐剂效应显著弱于其余3种鞭毛蛋白（P〈0.05）,高变区缺失鞭毛蛋白SJW61佐剂效应略有降低（P〉0.05）。

灭活DK128的佐剂效应:增强正常及CD4KO小鼠接种流感疫苗的Th1型免疫应答和免疫效力

从发酵蔬菜中分离得到的干酪乳酸菌DK128被认为具有激发先天免疫应答的作用。在此,作者研究了热灭活的DK128是否会在增强流感疫苗接种效果中显示出佐剂效应。用加入热灭活DK128的流感病毒疫苗免疫小鼠,其IgG1和IgG2c同型抗体均显著高于单纯疫苗免疫的小鼠。单剂DK128佐剂流感疫苗具有更高的保护力,这可以从小鼠肺功能完整、体重减轻更少、肺病毒清除能力增强、炎症细胞因子和浸润降低等方面得到证明。

免疫佐剂与壳聚糖

随着对疫苗研究的不断深入 ,人们发现黏膜蛋白疫苗是最有希望的疫苗 ,但其作用的发挥需要佐剂的参与 ,因此寻找一种安全有效的新型免疫佐剂成为发展疫苗首先必须解决的问题。而壳聚糖具有安全无毒等特性 ,国内外许多报道说明壳聚糖具有免疫调节和佐剂效应。此文就免疫佐剂及壳聚糖的免疫调节和佐剂效应作一简要综述。