骨髓间充质干细胞在小肠黏膜损伤小鼠体内的定植

目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植于小肠放射性损伤的小鼠体内后的定植情况.方法:体外培养扩增♂昆明小鼠MSCs,然后采用性别交叉移植的方法,即移植组:经尾静脉注射雄性小鼠MSCs进入小肠放射性损伤的雌性小鼠体内;对照组:注射等量无菌生理盐水.分别于第1、2、4周通过原位杂交检测Y染色体观察MSCs的定植情况.结果:移植组小鼠于移植后第1周即可检出Y染色体阳性荧光细胞的存在,呈零星散在分布,且多位于隐窝周围的黏膜下层,阳性率为19.48%±5.01%;第2周荧光细胞明显增多,阳性率为30.86%±12.14%,差异显著(P<0.05);第4周阳性率为35.92%±11.98%,差异不显著(P>0.05).结论:MSCs移植于小肠放射性损伤的小鼠体内后可以在小肠定植,且主要定植于黏膜下层.

铅结合蛋白PbrR的大肠埃希菌外膜展示株构建及体内定植初步研究

目的 构建铅特异性结合蛋白PbrR的大肠埃希菌外膜展示株，并考察其在小鼠体内的定植及外膜展示的重组蛋白在消化道内环境耐受能力。方法 全基因合成嵌合蛋白Lpp-OmpA编码序列，将其插入表达载体pET-21a，构建外膜蛋白展示载体pLOA。全基因合成PbrR编码序列，将其插入pLOA，构建PbrR外膜展示质粒pLOA-pbrr。转化表达宿主大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS，IPTG诱导表达，15% SDS-PAGE及Western blot分析表达情况。考察PbrR外膜展示株在人工肠液中的铅吸附能力及在人工胃液中的存活能力。KM小鼠经口连续7 d给予诱导后的展示株，终止染菌后，继续饲喂至30 d，稀释涂平板法检测第7、15、30天小鼠粪便中重组菌含量，免疫印迹法检测第7和第15天小鼠粪便中的重组蛋白残留。结果 基于Lpp-OmpA展示载体，成功构建了PbrR的外膜展示质粒。融合蛋白Lpp-OmpA-PbrR-His tag得到了高水平表达，展示株在人工肠液中表现出了显著升高的铅离子吸附能力。展示株表现出了一定的胃酸耐受性，经口染菌后可定植于小鼠肠道，外膜展示的重组融合蛋白对消化道内环境表现出较好的抵抗能力。结论 大肠埃希菌PbrR外膜展示株在体外模拟肠道环境中表现出了较强的铅富集能力，体内可定植小鼠消化道，外膜展示蛋白也有较好的消化液耐受能力。本文为进一步基于动物模型的生物吸附选择性驱铅的研究提供基础资料。

大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌的增殖效果研究

[目的]探究大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌生长的影响,为乳酸菌体内定植提供思路。[方法]试验组加入不同质量浓度的大豆低聚肽于MRS肉汤培养基中,培养嗜酸乳杆菌48 h测定OD_(600 nm);测定不同培养时间下嗜酸乳杆菌培养液的OD_(600 nm),绘制生长曲线;以300、600、1200 mg/kg剂量的大豆低聚肽-嗜酸乳杆菌菌悬液连续灌胃抗生素诱导的肠道菌群紊乱小鼠7 d,测定大豆低聚肽作用下小鼠体质量变化。[结果]40、30、20 mg/mL大豆低聚肽能明显增加嗜酸乳杆菌菌液浊度,促进嗜酸乳杆菌增殖;能使嗜酸乳杆菌培养12 h后进入对数生长期,提前进入快速增长状态并提高增长速度;低剂量组(300 mg/kg)、中剂量组(600 mg/kg)、高剂量组(1200 mg/kg)均能促进小鼠体质量增长,且600 mg/kg中剂量组体质量增加2.89 g,与阴性对照组差异显著。[结论]大豆低聚肽在体外能明显促进嗜酸乳杆菌增殖,添加的大豆低聚肽质量浓度为40 mg/mL时增殖效果最为显著。能促进小鼠体质量增长,但其促进乳酸菌的体内定植机制需要进一步评价。

植物乳杆菌促进黑腹果蝇生长发育

【目的】检测乳酸菌对果蝇发育历期的影响,进一步探讨其对果蝇促生长的分子机制。【方法】利用选择性培养基MRS从黑腹果蝇Drosophila melanogaster体内分离乳酸菌,利用革兰氏染色、生化方法及16S rRNA基因进行鉴定;通过体内定植和世代传递实验验证该菌是黑腹果蝇的共生菌;采用悉生模型检测乳酸菌对黑腹果蝇发育的促生长作用;利用实时定量PCR技术检测黑腹果蝇体内促前胸腺激素基因PTTH和胰岛素通路相关基因InR的表达水平;利用葡萄糖试剂盒检测血淋巴液葡萄糖浓度。【结果】从黑腹果蝇中分离到的菌株鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum FY1菌株(Gen Bank登录号:KY038178),可在黑腹果蝇肠道内定植,每个肠道定植量约为104CFU,并能在世代间稳定传递。FY1菌株体外发酵可降低p H值至5.2,可诱导无菌果蝇卵至蛹发育时间由20.0 d缩短至6.9 d,卵至成虫发育时间由30.0 d缩短至10.7 d,其生长速率是无菌果蝇的约2倍。实时定量PCR结果表明,FY1菌株显著地提前了PTTH表达高峰期,同时降低果蝇中InR表达水平,血淋巴液葡萄糖浓度从5.1 mg/mL降低至2.7 mg/mL。【结论】植物乳杆菌是黑腹果蝇的一种益生菌,推测能通过胰岛素信号通路促进宿主黑腹果蝇的生长和发育。

虹鳟肠道植物乳杆菌的分离及特性研究

为筛选一株乳杆菌用于鱼类口服疫苗的活载体,研究从健康养殖的虹鳟肠道分离出58株形态特征不同的菌株,通过革兰氏染色、氧化酶、触酶反应筛选出18株革兰氏阳性杆菌,再通过生化反应筛选出5株表型不同的菌株。经16S r RNA序列同源性分析,5株均为植物乳杆菌。在8%Na Cl,0.5%胆盐,p H 3.0,7 g·L-1胰蛋白酶,10 g·L-1胃蛋白酶,60℃处理10 min时,几乎不影响菌体存活。5株菌对多种抗生素敏感,对革兰氏阳性及阴性细菌均有抑菌活性。通过荧光分子探针c FDA-SE标记细菌,分离株L1212在15 d的检测期内能在虹鳟肠粘膜定植,并有继续繁殖倾向。因此,植物乳杆菌L1212可作为益生菌应用于虹鳟口服疫苗载体及鱼类饲料添加剂开发。

PbrR大肠埃希菌外膜展示株体内外生长特性

目的考察Pbr R大肠埃希菌外膜展示株在不同条件下的体内外生长特性,为其体内定植驱铅能力的研究奠定基础。方法 15%SDS-PAGE分析不同浓度诱导剂L-阿拉伯糖诱导展示菌p BAD-loa-pbrr/DH10B的重组蛋白表达情况;铅平板敏感实验对比重组菌诱导及非诱导条件下在含铅平板上的菌落形成能力;体外培养实验考察诱导剂的加入对重组菌生长能力及耐铅能力的影响;通过混合共培养实验对比诱导条件下重组菌与空宿主菌的竞争生长能力;考察重组菌6 h内的胃酸耐受性;考察诱导剂及染菌方式对重组菌小鼠体内定植的影响。结果低至0.002%的L-阿拉伯糖即可诱导重组蛋白的高效表达;Pbr R展示菌对铅表现出了一定的耐受力;诱导剂引入后重组菌生长能力降低;重组菌对胃酸有较好的抗性,经口染菌方式重组菌可定植于小鼠肠道,但摄入L-阿拉伯糖水后,粪便中重组菌快速丢失,通过连续染菌方式可维持其定植水平。结论重组菌体内外培养实验结果表明,基于商品化的诱导型表达载体构建的展示菌难以表达重组蛋白的同时实现小鼠体内的稳定定植。

双荧光探针分子两步标记益生菌在肠道原位活性分析研究

有效补充益生菌可有益肠道健康,但是益生菌在肠道原位活性的分析却鲜有报道。本研究通过将异硫氰酸荧光素(FITC)和5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯[5(6)-TAMRA-SE]分别与D-赖氨酸进行偶联,获得了两种颜色的荧光D-氨基酸(fluorescent D-amino acids, FDAAs)探针:绿色探针(fluorescein-D-lysine, FDL)和红色探针(TAMRA-D-lysine, TDL),并尝试对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus, LA)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei, LC)和韦荣球菌(Veillonella atypica, VA) 3种益生菌进行了体外标记。随后将FDAAs应用到小鼠肠道菌群标记,建立方法考察了3种常用益生菌口服定植存活情况。所有动物实验方案经由广州中医药大学动物伦理委员会审查通过。结果表明,合成的两种FDAAs可以无毒且完全对3种益生菌进行体外标记;通过FDAAs两步标记口服益生菌可知,LA存活率较高为92.30%±1.67%, LC和VA的存活率相近,分别为84.13%±4.06%、82.27%±2.43%。本研究可通过快速比较不同益生菌在体内定植存活率的变化,为益生菌在肠道原位定植活性提供理论支撑,同时对临床益生菌合理用药具有指导作用。