■木新芽变离体培养体系研究

为保存和加快繁殖(?)木新芽变材料,采用离体培养技术对外植体进行了愈伤组织诱导,分化,丛芽增殖和生根培养的研究．结果表明：叶片形成的愈伤组织都不分化,而茎段愈伤组织在含细胞分裂素 BA,KT 的培养基中均可分化,以 MS+KT0．6+IBA0．5培养基分化效果好,分化率达3．0个芽/块．1/2MS+IBA 2 mg/L 培养基最适合生根培养；芽变材料在黑暗条件下生根率达100%．

奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立

通过乳汁中提取细胞进行传代培养获得增殖且可分泌特异性酪蛋白的奶牛乳腺上皮细胞,细胞形态以鹅卵石型和多角型为主,逐渐趋于多角型。当多角型细胞增殖融合到一定阶段,会出现乳头状和圆顶型结构。并进一步对泌乳中后期乳汁分离的细胞做细胞生物学性状检测:细胞接种存活率达到81%;细胞生长曲线呈典型的“S”形,符合细胞生长的一般生物学规律;细胞群体倍增时间最短达48.7 h;经过对乳腺上皮细胞特异性分泌蛋白-酪蛋白的检测,证明培养获得的细胞为乳腺上皮细胞,且具有正常分泌乳蛋白功能。试验初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系。

体外培养体系对牛体外受精胚胎性比的影响

研究了不同体外培养体系对牛体外受精胚胎性比的影响。结果表明,添加血清的2组培养系统中所得雄性囊胚与雌性囊胚的性比虽偏离了1∶1,但差异不显著(P>0.05),而总的体外胚胎的性比则显著偏离了1∶1(P<0.05)。这说明在体外培养系统中雄性胚胎比雌性胚胎发育能力更强,并且血清的存在对于雄性胚胎的发育有明显的促进作用。

滑膜细胞原代体外培养体系的建立

目的:改善体外分离、培养滑膜细胞的方法,并对其鉴定。方法:取人滑膜组织采用机械分离、复合酶消化后再将组织块塑料孔板倒贴法,差速贴壁法纯化后培养,倒置显微镜观察生长情况,HE染色,细胞活力测定,免疫组化鉴定。结果:分离培养的滑膜细胞呈梭形或柱形,核呈卵圆形位于细胞中央,生长好、纯度高。细胞活力测定大于95%,免疫组化鉴定:波形蛋白vimentin(+),CD68(-)。结论:成功分离了人滑膜细胞,方法简便易行,为进一步研究提供良好的实验模型。

新生猪胰岛细胞团的体外培养体系

目的分离纯化新生猪胰岛细胞团(NPCCs),以不同的体外培养方式促进NPCCs成熟,筛选最佳方案。方法利用供龄分别为3天的新生猪,参考Bonner-Weir法和Hill法分离纯化NPCCs,分别以培养体系Ⅰ(90%DMEM、10%胎牛血清、双抗、2 mmol/L谷氨酰胺+0.01%大豆胰酶抑制剂)和培养体系Ⅱ(90%DMEM、10%胎牛血清、双抗、2 mmol/L谷氨酰胺+0.01%大豆胰酶抑制剂、10 mmol/L烟碱、10 ng/mL表皮细胞生长因子、15 ng/mL胰岛素样生长因子)体外培养14天,进行抗胰岛素、抗CK7双荧光染色和胰岛素刺激释放实验。结果应用培养体系Ⅰ的NPCCs体外培养14天时,抗胰岛素阳性细胞(β细胞)百分比为(28.6±5.3)%,显著低于培养体系Ⅱ的(62.1±9.0)%(P(0.01);培养体系Ⅰ的抗CK7阳性细胞(原始导管细胞)百分比为(52.8±7.2)%,显著高于培养体系Ⅱ的(21.5±6.9)%(P(0.01)。培养体系Ⅰ的NPCCs体外培养14天时胰岛素刺激释放量为:低糖:(14.3±4.8)mU/L,高糖:(23.9±6.2)mU/L,高糖+茶碱:(38.5±8.2)mU/L,显著低于培养体系Ⅱ的释放量:(26.2±5.1)mU/L、(46.3±7.0)mU/L、(81.5±10.4)mU/L(P(0.01)。结论培养体系Ⅱ较培养体系Ⅰ更能促进NPCCs中β细胞发育成熟及CK7阳性细胞向β细胞转化,并使胰岛素刺激释放量提高。培养体系Ⅱ是微囊和移植前体外培养NPCCs的理想方案之一。

BIV92044毒株体外培养体系的建立

将携带BIV92044毒株的牛外周血单核细胞分别与新生牛脾细胞、肾细胞和肺细胞建立共培养，经过传代和PCR追踪检测及一些因子的处理，发现BIV92044毒株能够持续感染脾细胞，并且在脾细胞中对BIV的表达调控因子和一些外源因子都能做出应答，从而为BIV92044毒株的分子生物学研究建立了一个较好的体外培养体系。

小鼠植入后胚胎体外延时培养体系的应用进展

小鼠是研究哺乳动物中一种小型的模式生物,在研究非人灵长类以及人类胚胎之前,需要先在小鼠体内确定实验能否进行再转移到高等哺乳动物。现有体系的限制使小鼠胚胎只能在体外培养至E6.5,小鼠胚胎体外延时培养体系的建立对于理解胚胎植入后的关键事件以及分子机制有着非常重要的作用,更为人胚胎的发育研究提供有效平台。单细胞测序技术的发展为小鼠胚胎体外延时培养提供了新的可能,在这里我们介绍了小鼠植入后胚胎的普通体外延时培养体系、3D培养体系、单细胞测序技术在胚胎领域的应用,以及其未来可能的发展方向。

辽东楤木的离体培养及植株再生研究

以MS为基本培养基,通过调节6-芐氨基嘌呤(6-BA)、3-吲哚丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、3-吲哚乙酸(IAA)等4种生长素的配比和浓度,成功地用组织培养的方法获得辽东楤木茎尖、茎等部位诱导产生的愈伤组织和再生植株,结果表明:辽东楤木离体培养的愈伤组织诱导、分化成苗和分化生根的最佳激素配比为NAA0.01mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1、NAA0.02mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1和NAA0.01mg·L-1+IBA1.5mg·L-1,应用该技术体系的愈伤组织诱导率、分化率和再生植株成活率分别为94%、22.5%、98%,该技术体系为国内外同类研究的首次报道。

CA体外抗菌作用的血清药理学研究

中药CA是根据中医辨证理论制成的复方制剂，具有清热利湿、健脾解毒、涩肠止泻的功效，临床上主要用于防治大肠杆菌引起的仔猪下痢、腹泻。传统的中药体外抗菌试验通常是将中药或中药复方粗提剂直接加入体外培养体系或反应体系中，在试验过程中易受到其中电解质、渗透压、杂质等因素的干扰，影响药效的判断和评定。鉴于此，试验采用了较先进的中药血清药理学方法，即将中药复方经口给予动物，

检测重组细胞因子生物活性的细胞培养方法的探讨

目前有关造血的基因重组的细胞因子不断出现,如EPO、TPO、G-CSF、SCF及多种白介素等等。如何评价这些细胞因子的生物活性,已成为重要研究课题,基中对造血祖细胞的增殖分化的影响是一个重要的技术途径。本文就常用的几种体外培养体系及方法作一探讨,以提供检测基因重组细胞因子活性的有效方法。 ①培养体系的选择,大致分为二大类:琼脂培养法主要用于粒-巨噬系祖细胞CFU-GM;培养甲基纤维素法,用于CFU-E、BFU-E、

枸杞多糖对山羊精原细胞体外增殖的影响

为研究枸杞多糖对山羊精原干细胞体外增殖的影响,使用机械分离法、两步酶解法及差速贴壁获取纯度较高的山羊精原干细胞,使用碱性磷酸酶(AKP)染色法及免疫荧光染色法对山羊SSCs进行鉴定;通过添加不同浓度的LBP培养山羊精原干细胞,利用CCK-8法检测细胞增殖数量,筛选最佳体外培养浓度;分别测试细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及总抗氧化能力(T-AOC)的含量,最后运用real time PCR技术检测各试验组中Bcl-2和Bax、Bad基因的相对表达量。结果表明,与对照组相比,培养液中添加20μg/mL或40μg/mL的LBP均可以显著促进山羊精原细胞增殖(P<0.05)。与其他试验组相比,40μg/mL的LBP添加组的MDA含量、Bax、Bad基因相对表达量均显著降低,SOD及T-AOC的含量、Bcl-2基因相对表达量均显著升高。因此,在山羊精原细胞体外过程中添加40μg/mL的LBP最有利于促进细胞自我更新。

制约牛体外早期胚胎发育力的因素

本文综述了影响牛体外受精胚胎发育力的因素 ,这些因素主要归结为配子和培养系统等问题。就配子而言 ,主要探讨了卵母细胞的核与胞质成熟的程度和处于不同发情周期阶段的卵泡对卵母细胞发育力的影响 ,还讨论了精子对体外胚胎发育力的影响 ;本文最后分析了体外受精胚胎的培养系统问题 ,指出不同发育阶段的早期胚胎对营养物质代谢需求不同 ,从而需要制定不同的培养基 ,使早期胚胎按先后顺序分别在不同的培养基中发育 ,即用序贯培养法提高早期胚胎的发育力。

小尾寒羊腔前卵泡体外生长发育的研究

近20年来，胚胎移植、体外受精、核移植、转基因等胚胎工程技术在理论和生产应用上已取得了很大进展。然而，所有这些技术是建立在具有完全发育能力的卵母细胞的基础之上的。大量卵母细胞的体外成熟培养是这些技术的限速步骤之一。目前采用的有腔卵泡卵母细胞的体外成熟和超数排卵，不能提供充足的卵母细胞以支撑胚胎工程技术的进一步发展。此外，卵巢中的卵母细胞绝大多数以无腔的形式存在于卵巢皮质内，有腔卵泡所占比例不到1％，屠宰场屠宰羊只后的卵巢内含有大量的腔前卵泡。如果建立腔前卵泡的体外培养体系，获得大量的具有成熟和受精能力的卵母细胞，一方面将会最大限度地挖掘保存卵巢上遗传资源；另一方面将极大的促进胚胎工程技术的研究与应用，还有利于研究卵泡和卵母细胞的生长和发育规律。

幼龄羊的周龄及卵母细胞体外培养体系对JIVET技术的影响

为了探讨周龄及卵母细胞体外培养体系对幼龄羊胚胎体外生产技术（JIVET）的影响,试验对10只5-10周龄杜寒杂种羔羊进行激素诱导,获取卵母细胞,分别在基础成熟液和含200μmol/L半胱氨酸的成熟液里成熟,再分别在含2%发情羊血清（ESS）的Ⅰ受精液和含3 mg/m L牛血清白蛋白（BSA）的Ⅱ受精液里受精,测定不同周龄羔羊的采卵数量、卵母细胞成熟率和卵裂率。结果表明：5,7,8,10周龄羔羊获得卵母细胞数分别为（111.00±16.97）枚/只、（139.50±28.99）枚/只、（108.50±17.68）枚/只、（42.00±11.31）枚/只,5,7,8周龄羔羊显著高于10周龄羔羊（P〈0.05）;而5，7，8周龄羔羊之间差异不显著（P〉0．05）；试验成熟液获得的卵母细胞成熟率比基础成熟液高3.64百分点;Ⅰ受精液获得的卵母细胞卵裂率极显著高于Ⅱ受精液（P〈0.01）。说明选择5-8周龄羔羊、卵母细胞体外成熟液添加一定量半胱氨酸和体外受精液含一定量ESS可以改善JIVET体系。

仔猪胰腺细胞体外培养体系的建立

为了研究体外培养仔猪胰腺细胞的适宜条件,试验选取1日龄的仔猪胰腺组织置于冰上清洗、修剪,对消化酶、离心方式、培养皿铺被方式、培养液及添加不同促生长因子等多种因素进行筛选和优化。结果表明:0.25%胰酶消化所获得的细胞强于0.1%胶原酶消化获得的细胞,细胞清亮,易于生长;采用500 r/min离心5 min、多次离心所获得的细胞较Percoll不连续密度梯度离心和5%BSA等密度梯度离心所获得的细胞贴壁率高,生长能力强,易于培养传代;采用0.1%明胶或20μg/mL的层黏连蛋白铺被培养皿均比无铺被的培养皿获得更多的贴壁细胞;以RPMI 1640、M199、F12、L-DMEM多种培养液培养仔猪胰腺细胞,表现出多种细胞形态和生长趋势;在基础培养液中添加上皮生长因子、角质化生长因子、β-巯基乙醇和白血病细胞抑制因子、转铁蛋白与亚硒酸盐混合试剂等促干细胞增殖因子可促进不同形态细胞的增殖。说明按此方式培养可获得大量、多种细胞形态的仔猪胰腺祖/干细胞。

猕猴核移植研究进展及前景(待续)

本文回顾了猕猴核移植相关简史 ,介绍了猕猴核移植的技术路线 ,对限制猕猴体细胞核移植研究的因素 :核供体的筛选、卵母细胞的获得、超数排卵的影响因素、重构胚的激活及体外培养体系等进行了综述 。

人脐带血间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的研究脐带血来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要;探讨经尾静脉移植脐血间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响。方法无菌条件下采集健康育龄产妇正常分娩胎儿的脐带血42份,脐血随机分成3组:FBS(胎牛血清)未包被组、FBS包被组和mesencult培养基组。FBS未包被组和FBS包被组均使用含10%FBS的LG-DMEM培养基、mesencult培养基组使用专用来培养干细胞的mesencult培养基,与其添加物配合使用。3组均用Ficoll淋巴细胞分离液,密度梯度法分离脐血单个核细胞(MNC),将单个核细胞按密度1×108/ml接种于T25培养瓶中,置37℃饱和湿度含5%CO2孵育箱培养,72 h后全量换液,去除未贴壁细胞,以后均7 d换液1次。待细胞长到80%铺满瓶底时结束原代培养。按1∶1进行消化传代。观察不同培养条件对脐血MSCs生长的影响。取P2代细胞用流式细胞仪检测细胞表面CD 29、CD 34、CD45、CD 105标志。将36只SD大鼠随机分成MSCs移植组、假手术组和心肌梗死植组各12只,结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死模型。心肌梗死后1周,经尾静脉注射脐血MSCs,4周后测定大鼠血流动力学。结果 42份脐血中单个核细胞原代培养,其中仅8份传代培养成功,而其中mesencult条件培养基有5份培养成功,明显高于FBS包被组(3份)和FBS未包被组(0份)。流式细胞仪检测第2代的脐血MSCs结果显示,P2代MSCs不表达或极弱表达CD 34,CD45造血细胞标志,稳定地高表达CD 29、CD 105间充质细胞相关的表面抗原标记。这与骨髓MSCs的表面抗原标志相一致。移植后4周,经血流动力学检测,与心梗组比较,MSCs移植组左室心功能明显改善(P<0.05)。结论将脐血单个核细胞以高密度(1×108cells/ml)接种在mesencult培养基中可以在体外成功培养出较纯化的脐血MSCs,其培养成功率较高。脐血MSCs的免疫表型符合间充质干细胞特征。脐血MSCs移植能促进心梗大鼠心功能恢复。

视黄酸对人胸腺细胞分化作用及其机理的研究

目的 :研究视黄酸调节胸腺细胞分化的作用及其机理。方法 :采用体外胸腺器官培养体系 ,在培养体系中加入视黄酸或受体拮抗剂。在培养的不同时间收集胸腺细胞 ,用荧光标记的抗 CD3、CD4、CD8抗体染色 ,并进行流式细胞仪分析 ,观察胸腺细胞成熟分化的变化。胸腺细胞抽提的 RNA采用实时定量 PCR法检测视黄酸受体 α( RARα) m RNA的表达。结果 :体外胸腺器官培养体系能支持胸腺细胞的发育成熟。 RA在培养的 2 4h促进胸腺细胞向 CD4+分化发育 ,并且该作用可被 RARα特异性拮抗剂 Ro41- 5 2 5 3所拮抗。实时定量 PCR结果显示 ,胸腺细胞表达 RARα m RNA,RA能促进 RARα m RNA的表达 ,并且 RARα m RNA表达水平与 CD4+ CD8+ 胸腺细胞百分数之间存在正相关 ( r=0 .5 93 ,P=0 .0 42 )。结论 :RA对胸腺细胞分化发育具有重要的调节作用 ,RA可能通过影响 RARαm