体外修饰树突状细胞诱导免疫耐受的研究

目的:探讨体外联合应用白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)和甲基强的松龙(methylprednisolone,Medron)修饰供体树突状细胞(dendritic cell,DC)对小鼠皮肤移植术后免疫耐受的诱导效果,为抗移植术后免疫排斥反应治疗提供依据。方法:以健康成年C57BL/6小鼠为供体。BALB/c小鼠为受体,随机分为6组。除A组外,其余各组均于皮肤移植前3d自尾静脉输入对应的供体DC。具体对应关系如下:A组为空白对照,尾静脉输入生理盐水;B组为输入未修饰的DC;C组为20μg/L IL-10处理组;D组为10mg/L Medron处理组:E组为20μg/L IL-10+10mg/L Medron处理组。同时设立F组,为BALB/c对BALB/c的同种同基因皮片移植。各组行皮肤移植术,观察受体移植皮片存活情况。结果:E组的移植皮片存活时间最长,与其它各处理组相比P＜0．05,存在统计学差异。结论:用IL-10和甲强龙修饰的供体树突状细胞对受体进行预处理,可明显延长移植皮片的存活时间。

类泛素修饰蛋白bISG15抗血清在体外修饰系统中的应用(英文)

ISG15由干扰素刺激基因15编码,是最早被发现的类泛素修饰分子.病毒感染以及干扰素刺激可以强烈诱导其表达.与泛素类似,ISG15可以共价连接到其他蛋白分子上进行修饰,但ISG15及其连接修饰的功能作用还有很多尚未知.最近的研究表明,ISG15及其修饰作用在先天免疫中起着重要的作用.将牛类ISG15基因克隆进入pET28a( +)原核表达载体,并且表达了可溶的融合有His-tag标签的bISG15融合蛋白.使用Ni-NTA葡聚糖进行纯化浓缩.纯化蛋白免疫Balb/c小鼠并获得抗血清.Western印迹实验显示,抗血清可以特异地识别在真核细胞中表达的bISG15 .浓缩的bISG15以及制备的抗血清用于建立bISG15的体外修饰系统.实验证明,使用该系统bISG15可以连接到细胞蛋白上进行修饰.

MUC1/Y基因真核表达载体构建及MUC1、MUC1/Y体外修饰DC诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的 构建MUC1 Y全长cDNA真核表达载体 ,并以MUC1及MUC1 Y真核表达载体修饰树突状细胞 (DC)诱导特异性抗肿瘤免疫。方法 构建MUC1 YDNA真核表达载体 ,选取 10例HLA A2乳腺癌患者 ,体外IL 4、GM CSF联合诱导DC ,并以pCDNA3.1 MUC1和pCDNA3.1 MUC1 Y转染DC ,同时以空载体为对照 ,以pIRES2 EGFP MUC1 Y观察转染效率 ,转染后DC与自体T细胞混合培养 ,诱导CTL。以MCF 7为特异性靶细胞 ,Raji为非特异性靶细胞 ,通过乳酸脱氢酶释放实验检测杀伤活性 ,以annexinⅤ FITC检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡的情况。以ELISA法测定基因修饰后DC刺激自体T细胞分泌IFN γ的能力。结果 酶切鉴定及测序结果表明成功构建了MUC1 Y真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1 Y和pCDNA3.1 MUC1 Y。pIRES2 EGFP MUC1 Y转染效率基本为 10 %左右 ,DC中MUC1表达率为 8%。杀伤实验表明T DC pCDNA3.1 MUC的杀伤活性为 6 4 % ,T DC pCDNA3.1 MUC1 Y为 4 6 %。这两组间差异有显著性 ,同时与对照组比较差异均有显著性。annexinⅤ FITC标记实验显示 ,T DC pCDNA3.1 MUC1对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于T DC pCDNA3.1 MUC1 Y及对照组。基因修饰DC刺激自体T细胞分泌IFN γ的能力显著升高。结论 构建的真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1

间充质干细胞体外修饰治疗急性肾损伤的研究进展

急性肾损伤（AKI）是以肾功能迅速下降为特征的一组综合征，病情进展至后期则演变为急性肾衰竭，多由于手术、外伤、放射介入以及肿瘤化疗等所诱发。据不完全统计，AKI在中国综合性医院总发病率为5％～18％，在重症监护病房则高达67％，病死率30％-80％。

间充质干细胞来源外泌体靶向修饰在眼病治疗中的应用前景

间充质干细胞(MSCs)具有免疫调节和促血管生成的特性,在细胞治疗中具有广泛的应用前景。外泌体是一类具有脂质双分子层结构的纳米级小囊泡。近年研究表明,外泌体具有与MSCs类似的生物学功能,可替代MSCs用于多种疾病的治疗。间充质干细胞来源外泌体(MSCs-exo)被广泛应用于包括葡萄膜炎、青光眼、视网膜和眼表疾病在内多种眼科疾病的治疗研究。然而,MSCs-exo内容物复杂,功能多样,为避免被免疫系统快速清除、提升靶向细胞特异性、减少不良反应,需要对外泌体进行不同策略修饰。如MSCs-exo内容物修饰后,使治疗因子过度表达,可最大限度地发挥其对特定眼病治疗的潜力和疗效,有望成为眼病治疗的新选择。本文重点阐述MSCs-exo应用和外泌体修饰的策略和现状,并探讨MSCs-exo修饰在眼病治疗中的潜在应用前景。

外泌体在肿瘤转移和耐药相关研究中的进展

外泌体是一种由机体各种细胞分泌的细胞外囊泡,分布于多种体液中,参与机体的各种生理和病理活动,并发挥重要作用。本文介绍外泌体的结构和功能,综述外泌体在肿瘤微环境中诱导免疫反应、肿瘤转移及耐药的作用机制。通过对外泌体修饰的研究,本文展望外泌体更广阔的应用前景。

蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的构建

【目的】构建一种可获得Sumo修饰蛋白的原核表达系统,为Sumo化修饰蛋白的批量制备奠定基础。【方法】用Trizol裂解法提取小鼠畸胎瘤细胞F9的总RNA,反转录成cDNA后PCR扩增获得Sumo1、Ubc9、Sae2和Sae1基因。将上述基因及相应载体酶切、连接后构建出重组质粒pACYC-Ubc9-Sumo1、pCDF-Sae2-Sae1。采用质粒转化-制备阳性克隆感受态细胞-质粒转化的方法获得pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1共表达的Su-mo化修饰的原核表达系统。以pGEX-GST-Sox2和pGEX-GST-Sox2K247R重组质粒为例,采用Western Blot检测蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的有效性。用另一Sumo修饰底物Oct4及其Sumo修饰位点突变的突变体Oct4K118R转化原核Sumo修饰系统,并连续传代,检测蛋白质Sumo化修饰系统的实用性及遗传稳定性。【结果】构建的蛋白质Sumo化修饰原核表达系统可特异修饰Sumo1的底物Sox2和Oct4;含有Oct4原核表达载体的蛋白质Sumo化修饰系统可稳定传至15代,系统的稳定性较好。【结论】获得了成本较低、特异性强、重复性好、稳定性强的可用于制备Sumo化蛋白的原核表达系统。

成纤维细胞生长因子21的修饰方法及临床应用价值

成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)是机体在应激状态下诱导产生的激素,在调节糖脂代谢及能量稳态方面发挥重要的作用。研究发现,FGF21具有减轻体重、降低血糖、提高胰岛素敏感性、改善血脂异常、改善心血管疾病等生理活性,也是近年来非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)药物研发中最受关注的靶点之一。但是由于FGF21稳定性差、半衰期短,导致FGF21在临床应用中药效较差,因此定点突变、体外修饰及融合表达等技术被用于FGF21的改造,通过突变酶切位点、引入二硫键、增加分子量等手段达到提高稳定性、延长半衰期、增强药效的目的。本文详细介绍了近年来处于临床及临床前研究中FGF21类似物的修饰、改造方法及临床前和临床研究成果,为FGF21药物的开发提供参考。