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体外催化花生四烯酸生产前列腺素F_(2α)
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作者 范潇 何国威 +4 位作者 黄薇 童建华 卢向阳 田云 刘虎虎 《中国油脂》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期114-119,共6页
前列腺素F_(2α)(PGF_(2α))具有广泛的生理活性,是一种重要的脂质介质。为了实现PGF_(2α)的绿色生物合成,构建了pET30a-TbPGFS、pET30a-MmPGHS、pET30a-GvPGHS载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达,同时对异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IP... 前列腺素F_(2α)(PGF_(2α))具有广泛的生理活性,是一种重要的脂质介质。为了实现PGF_(2α)的绿色生物合成,构建了pET30a-TbPGFS、pET30a-MmPGHS、pET30a-GvPGHS载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达,同时对异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件进行了优化以提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。另外,以最佳诱导表达条件下得到的重组蛋白为催化剂,催化花生四烯酸合成PGF_(2α)。结果表明:MmPGHS蛋白在大肠杆菌中没有表达;GvPGHS蛋白的最佳诱导表达条件为诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导温度30℃、诱导时间2 h,TbPGFS蛋白的最佳诱导表达条件为诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导温度30℃、诱导时间6 h;在最佳诱导表达条件下,由GvPGHS和TbPGFS的粗酶液构成的双酶催化未能检测到产物PGF_(2α),而在酶偶联化学催化时,GvPGHS能将花生四烯酸转化为PGH_(2),PGH_(2)被SnCl_(2)进一步还原为PGF_(2α)。综上,通过体外酶促反应结合化学法可高效转化花生四烯酸生产PGF_(2α)。 展开更多
关键词 花生四烯酸 前列腺素F_(2α) 体外催化 前列腺素H合成酶
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基于响应面法优化四氢嘧啶羟化酶体外催化合成5-羟基四氢嘧啶条件
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作者 王诗瑞 缪增强 +3 位作者 邢江娃 沈国平 朱德锐 李永臻 《中国高原医学与生物学杂志》 CAS 2023年第4期263-269,共7页
目的 基于响应面法对四氢嘧啶羟化酶(ectoine hydroxylase, EctD)催化反应体系进行优化,以四氢嘧啶(Ectoine, Ect)为底物,以温度、酸碱度和Ect、EctD浓度为影响因素,利用Box-Benhnken实验法研究各因素及其交互作用对EctD体外催化反应效... 目的 基于响应面法对四氢嘧啶羟化酶(ectoine hydroxylase, EctD)催化反应体系进行优化,以四氢嘧啶(Ectoine, Ect)为底物,以温度、酸碱度和Ect、EctD浓度为影响因素,利用Box-Benhnken实验法研究各因素及其交互作用对EctD体外催化反应效率的影响,以期获得EctD体外催化合成5-羟基四氢嘧啶(5-Hydroxyectoine, 5-HE)的最优条件。方法 分别以Ect浓度、温度和酸碱度为自变量,在1 mM Fe^(2+)、10 mM α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)和10 mM TES缓冲液及EctD液组成的反应体系中反应25 min后,利用高效液相色谱仪(HPLC)检测5-HE的合成量,得到各单因素对酶催化反应的影响情况,并利用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析;以单因素实验结果为基础,选择X1(温度)、X2(酸碱度)、X3(Ect浓度)、X4(EctD浓度)为影响因素,以5-HE合成量为响应值,设计4因素3水平响应面Box-Benhnken实验29组,每组实验重复3次,其数据以平均值±标准差表示,并用Design-Expert 12.0软件进行统计分析。结果 单因素实验结果显示,EctD在体外催化5-HE的合成量随着酸碱度和温度的增加呈现先升高后降低趋势,当酸碱度为7、温度为35℃时5-HE合成量达到最高值;而Ect浓度在1.25~1.5 mM时,5-HE的合成量无明显变化,说明此时底物Ect与酶催化中心的结合达到饱和。通过Box-Benhnken实验得到的回归方程及结果的方差分析表明,该模型的F为9.41,P<0.0001,失拟项P为0.0634,说明回归方程可信。回归方程一次项系数绝对值的大小依次为X4(EctD浓度)>X3(Ect浓度)>X1(温度)>X2(酸碱度),说明X4(EctD浓度)是影响EctD催化合成5-HE的显著因素,而X2(酸碱度)对其影响较小。与此同时,X1(温度)与X4(EctD浓度)的交互作用对酶催化反应也具有显著影响。结论 EctD体外催化合成5-HE的最优反应条件:温度为35℃、pH为7、Ect浓度为1 mM、EctD浓度为0.6 U/mL、Fe^(2+)浓度为1 mM、α-ketoglutarate浓度为10 mM。温度是影响酶催化的主要外界因素。 展开更多
关键词 四氢嘧啶羟化酶 5-羟基四氢嘧啶 催化 响应面法 条件 优化
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二氧化碳微生物转化与体外酶催化体系研究进展 被引量:2
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作者 叶伟 李芮 +1 位作者 姜卫红 顾阳 《合成生物学》 CSCD 2023年第6期1223-1245,共23页
二氧化碳(CO_(2))是主要的温室气体,但同时也是一种储量巨大、廉价、安全且易得的可再生资源。在我国“碳达峰、碳中和”战略目标的驱动下,如何有效减少CO_(2)排放并转而利用这一重要碳资源已成为当前的研究热点与重点,这同时也加快了CO... 二氧化碳(CO_(2))是主要的温室气体,但同时也是一种储量巨大、廉价、安全且易得的可再生资源。在我国“碳达峰、碳中和”战略目标的驱动下,如何有效减少CO_(2)排放并转而利用这一重要碳资源已成为当前的研究热点与重点,这同时也加快了CO_(2)捕集、利用与封存(carbon capture,utilization and storage,CCUS)技术的发展和创新。生物转化是实现CO_(2)利用的主要路径之一,既能够直接催化、转化CO_(2)合成目标产物,也可以与化学催化路径相耦合实现对CO_(2)来源的有机低碳资源(如甲醇、甲酸、乙酸)的有效转化及定向合成,因此有望在国家“双碳”目标的实现中发挥重要作用。本文对近年来CO_(2)生物转化的研究进展进行了梳理和总结,指出了现有技术路线的特点和不足,并对今后的研究重点和方向提出了建议。总体而言,CO_(2)生物利用技术目前尚处于起步阶段。基于化能自养细菌的合成气(CO_(2)/CO)发酵生产乙醇虽已实现工业化,但仍需要进一步优化和提高CO_(2)的转化利用效率,并获得除乙醇外更多的高值产品,从而提升整个技术路线的经济性。而其他的CO_(2)生物转化路径,无论是化学-生物发酵耦合还是体外酶催化,目前离大规模应用还有较大距离,需要进一步优化技术体系和降低成本来满足工业化需求。 展开更多
关键词 二氧化碳 有机低碳 生物利用 催化 高附加值产品
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拟南芥肌醇半乳糖苷合成酶与棉子糖合成酶的体外催化活性比较 被引量:2
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作者 郑小芬 李晓霞 +6 位作者 黄金兰 余方回 刘妙玲 范芳 黄迎娣 张玲 周英彪 《生物技术》 CAS 2019年第1期69-76,共8页
[目的]基因克隆及原核表达纯化后比较拟南芥的2个肌醇半乳糖苷合成酶及2个棉子糖合成酶的体外催化活性,为微生物法或酶法合成棉子糖尊定基础。[方法]RT-PCR克隆拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)... [目的]基因克隆及原核表达纯化后比较拟南芥的2个肌醇半乳糖苷合成酶及2个棉子糖合成酶的体外催化活性,为微生物法或酶法合成棉子糖尊定基础。[方法]RT-PCR克隆拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)的基因,分别构建原核表达菌株,诱导表达纯化获得酶,电泳检测及蛋白定量后进行体外酶催化反应,HPLC分析产物。[结果]克隆到GolS1与GolS3及RafS1与RafS5的基因,原核表纯化获得纯酶,以反应体系中目标产物生成速率衡量,GolS1与GolS3催化速率分别为0.51和0.28mmol/(mg·min),RafS1与RafS5的催化速率分别为0.45和0.21mmol/(mg·min)。[结论]拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)基因经异源表达后具有良好酶活,其中GolS1酶活是GolS3的1.82倍,RafS1酶活是RafS5的2.14倍。 展开更多
关键词 棉子糖 肌醇半乳糖苷合成酶 棉子糖合成酶 拟南芥 基因克隆 体外催化活性
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酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶的异源表达及催化生成糠硫醇
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作者 扎木苏 杨华青 +3 位作者 王鑫 孙宝国 王成涛 卢松 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第6期55-61,共7页
为明晰糠硫醇生物转化机制,将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G20的胱硫醚β-裂解酶(cystathionineβ-lyase,Str3p)在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源表达,并验证其催化性质。正交设计试验优化大肠杆菌基因工程菌蛋白... 为明晰糠硫醇生物转化机制,将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G20的胱硫醚β-裂解酶(cystathionineβ-lyase,Str3p)在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源表达,并验证其催化性质。正交设计试验优化大肠杆菌基因工程菌蛋白表达的诱导条件,其最适诱导表达条件为诱导温度20℃、异丙基硫代半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间13 h。该条件下获得的菌体经超声破碎和镍柱亲和层析,纯化得到的可溶性Str3p分子质量约为52 kDa,其表达量达1.26 mg/mL,较优化前的表达量和酶活力分别提高41.7%和38.6%。实验发现Str3p能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物生成糠硫醇,且催化过程受pH值影响较大,在pH 8.0时糠硫醇产量达到47μmol/L。本研究确定Str3p在E.coli BL21中的异源表达及催化特性,为生物转化合成天然糠硫醇提供新的参考途径。 展开更多
关键词 酿酒酵母 胱硫醚β-裂解酶 异源表达 体外催化 糠硫醇
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Influence of external nitrogen-containing donors on polymerization behavior of neodymium-based cis-1,4-polybutadiene rubber
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作者 LI Xin DONG Jing +3 位作者 HAN Zhuo-ling WANG Feng ZHANG Xue-quan LIU Heng 《合成橡胶工业》 CAS 2024年第5期438-438,共1页
Neodymium(Nd)-based catalyst in butadiene(Bd)polymerization has drawn interests due to its availability in affording higher cis-1,4-unit selectivity than transition metal(Ti,Co,Ni,etc.)-based catalysts[1-2].Such outst... Neodymium(Nd)-based catalyst in butadiene(Bd)polymerization has drawn interests due to its availability in affording higher cis-1,4-unit selectivity than transition metal(Ti,Co,Ni,etc.)-based catalysts[1-2].Such outstanding high cis-1,4-unit selecti-vity is hypothetically originated from the presence of 4 f orbitals,that can participate in monomer coordination and thereby govern subsequent enchainment manners.This unique characteristic also renders the active species highly susceptible to Lewis bases,and may impact the overall selectivity as well as polyme-rization behavior after coordination.Nevertheless,it is still a virgin area in such a field,and the influence of Lewis bases on Nd-based diene polymerizations is still a black box.Based on this consideration,how nitrogen-containing donors(D)impacts the overall behaviors of Nd-mediated Bd polymerizations is disclosed. 展开更多
关键词 POLYMERIZATION BASES SELECTIVITY
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dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖多酶催化体系的构建与优化
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作者 程星诺 康前进 白林泉 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期1475-1486,共12页
本研究的目的是构建高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径。参考Actinoplanes sp.SE50/110中dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖的生物合成过程,选取了来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的D-葡萄糖-胸腺嘧啶转移酶RfbA和dTD... 本研究的目的是构建高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径。参考Actinoplanes sp.SE50/110中dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖的生物合成过程,选取了来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的D-葡萄糖-胸腺嘧啶转移酶RfbA和dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶RfbB,以及4种不同来源的氨基转移酶:来自Streptomyces venezuelae的DesI、来自大肠杆菌的GerB和WecE以及来自Shigella dysenteriae的VioA,经纯化获取了具有良好催化活性的目标蛋白。使用质谱检测各蛋白的转化效率,RfbA和RfbB的转化率分别为18.89%和98.34%;在4种氨基转移酶中VioA的反应转化率最高,可以达到41.67%。首先对RfbA催化的胸腺嘧啶转移反应进行条件优化,在最适条件下RfbA的转化率提高至32.14%。其次对VioA催化的氨基转移反应进行优化,在反应体系中加入谷氨酸脱氢酶形成催化循环,重复生成谷氨酸,推动可逆反应正向移动,转化率提高至近100%。最后扩大反应体系,得到了目标化合物dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖。本研究成功构建了高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径,并且引入谷氨酸脱氢酶重复生成谷氨酸,极大地提高了可逆反应的转换效率。设计的体外多酶催化体系不仅可以用于获得阿卡波糖生物合成的关键中间体,也可用于获得具有类似生物合成过程的其他氨基双脱氧糖或糖核苷酸类化合物。 展开更多
关键词 阿卡波糖 氨基双脱氧糖 氨基转移酶 多酶催化
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解纤维素热酸菌来源的耐热磷酸酶的酶学性质与应用 被引量:2
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作者 白雪 李运杰 +3 位作者 孟冬冬 魏欣蕾 路福平 游淳 《生物加工过程》 CAS 2021年第2期123-129,共7页
卤代酸脱卤酶(HAD)超家族的磷酸酶,其底物谱广泛,催化功能多样,因此鉴别和表征耐热的磷酸酶对于其在生物制品生产中的应用具有重要意义。对解纤维素热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)来源的磷酸酶(AcPase)进行研究,将其基因经密码子... 卤代酸脱卤酶(HAD)超家族的磷酸酶,其底物谱广泛,催化功能多样,因此鉴别和表征耐热的磷酸酶对于其在生物制品生产中的应用具有重要意义。对解纤维素热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)来源的磷酸酶(AcPase)进行研究,将其基因经密码子偏好性优化后,在E.coli Rosetta(DE3)中进行异源表达,并由HisTrap树脂柱分离纯化重组蛋白,研究其酶学性质。结果发现,该酶属于Mg^(2+)依赖型的磷酸酶,最适温度为65℃,最适pH为6.0。AcPase在45~65℃的条件下稳定,在45℃的半衰期为17.4 h,展现出很好的热稳定性。AcPase在50℃下对D-葡萄糖-6-磷酸有较高的催化活性,比酶活为0.68 U/mg。由于AcPase对D-葡萄糖-6-磷酸具有较高的催化活性,笔者进而构建了一个基于该磷酸酶的纤维素磷解多酶催化系统,通过4个酶的体外多酶级联催化将纤维素转化成葡萄糖,底物转化率达到97.6%。该研究通过对一个偏好D-葡萄糖-6-磷酸的磷酸酶的表征,为纤维素完全转化提供了新的研究思路。 展开更多
关键词 卤代酸脱卤酶 磷酸酶 底物谱 酶学性质 多酶级联催化
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UV-Catalytic Treatment of Municipal Solid-Waste Landfill Leachate with Hydrogen Peroxide and Ozone Oxidation 被引量:16
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作者 TahirImranQURESHI Hong-TaeKIM 《Chinese Journal of Chemical Engineering》 SCIE EI CAS CSCD 2002年第4期444-449,共6页
The performance of UV/H_2O_2, UV/O_3, and UV/H_2O_2/O_3 oxidationsystems for the treatment of municipal solid-waste landfill leachatewas investigated. Main objective of the experiment was to removetotal organic carbon... The performance of UV/H_2O_2, UV/O_3, and UV/H_2O_2/O_3 oxidationsystems for the treatment of municipal solid-waste landfill leachatewas investigated. Main objective of the experiment was to removetotal organic carbon (TOC), non-biodegradable organic compounds(NBDOC) and color. In UV/H_2O_2 oxidation experiment, with theincrease of H_2O_2 dosage, removal efficiencies of TOC and coloralong with the ratio of biochemical oxygen demand (BOD) to chemicaloxygen demand (COD) of the effluent were increased and a betterperformance was obtained than the system H_2O_2 alone. 展开更多
关键词 photochemical degradation UV/ozone UV/hydrogen peroxide advancedoxidation process
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电-氢-糖循环的新能源体系研究进展 被引量:2
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作者 宋云洪 吴冉冉 +6 位作者 魏欣蕾 石婷 李运杰 游淳 张玲玲 朱之光 张以恒 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期4081-4100,共20页
发展绿色低碳的可再生能源体系已经成为重要的国际共识和方向,也是我国践行“双碳”目标、保障能源安全、走社会可持续发展的必要路径。本文聚焦电-氢-糖(electricity-hydrogen-carbohydrate,EHC)循环的新能源理论体系,重点综述了中国... 发展绿色低碳的可再生能源体系已经成为重要的国际共识和方向,也是我国践行“双碳”目标、保障能源安全、走社会可持续发展的必要路径。本文聚焦电-氢-糖(electricity-hydrogen-carbohydrate,EHC)循环的新能源理论体系,重点综述了中国科学院天津工业生物技术研究所10余年来在基于体外多酶催化系统(in vitro synthetic enzymatic biosystem,ivSEB)的糖与水反应制氢、糖完全氧化产电,以及氢或电能固定CO_(2)到糖的生物转化方面所做的工作,阐述体外多酶催化系统的设计原则、分子基础,并从电-氢-糖循环进一步延伸出以糖(淀粉)为核心的体外合成生物制造,结合最新相关研究进展,分析讨论体外多酶催化体系的特色和优缺点,并展望未来发展方向,促进经济和社会的绿色低碳可持续发展。 展开更多
关键词 电-氢-糖循环 新能源 多酶催化系统 糖水制氢 生物制氢 糖产电 酶燃料电池 人工电子传递链 CO_(2)产淀粉
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钙霉素聚酮链释放亚基蛋白性质优化及底物选择性
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作者 李希希 王嘉良 +4 位作者 曹卫 李丹丹 邓子新 汪志军 梁晶丹 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期194-205,共12页
【目的】钙霉素合成酶亚基CalA3释放钙霉素合成过程中的聚酮链。获得生物化学性质稳定、蛋白结构性质均一的CalA3蛋白,可用于冷冻电镜(cryo-electron microscopy)结构解析,以帮助理解装配线型聚酮合酶亚基释放聚酮链的生物化学机理。探... 【目的】钙霉素合成酶亚基CalA3释放钙霉素合成过程中的聚酮链。获得生物化学性质稳定、蛋白结构性质均一的CalA3蛋白,可用于冷冻电镜(cryo-electron microscopy)结构解析,以帮助理解装配线型聚酮合酶亚基释放聚酮链的生物化学机理。探究CalA3对不同关键结构特征的聚酮链底物的选择性,可为制备CalA3与小分子化合物的复合物提供生化材料,同时也为进一步挖掘CalA3的成酰胺键的应用潜能提供借鉴。【方法】优化CalA3蛋白异源表达菌株的培养条件、CalA3蛋白纯化的生化条件,利用负染电镜观察蛋白形态,计算并分析蛋白质结构的性质;测定CalA3对不同结构的直链聚酮类似物的体外催化活性,利用色谱和质谱分析鉴定CalA3催化N-乙酰半胱氨酸-吡咯-2-丙酸(SNAC-C3)、N-乙酰半胱氨酸-戊酸(SNAC-C5)和月桂酰辅酶A等多种不同结构的直链聚酮底物类似物与3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxy anthranilic acid,3HA)反应的产物。【结果】利用优化后的培养基PGTY,不仅实现了高纯度巨型聚酮合酶CalA3超量异源表达,同时,负染电镜观察、计算分析表明蛋白颗粒的结构性质优异。使用该条件纯化获得的CalA3蛋白,可以用于制备冷冻电镜样品,进行结构解析。CalA3催化SNAC-C3、SNAC-C5与3HA发生氨解反应,未检测到CalA3对月桂酰辅酶A底物的催化活性。【结论】蛋白纯化和负染电镜结果显示,本研究成功建立了CalA3异源表达的大肠杆菌培养条件、蛋白纯化生化条件。体外催化实验结果表明CalA3对聚酮链底物的结构选择具有宽泛性。这些发现为进一步探究聚酮合酶的结构、功能及应用提供了一定的借鉴。 展开更多
关键词 聚酮合酶 培养基 钙霉素合成酶CalA3 冷冻电镜 底物特异性 体外催化 聚酮类似物 结构鉴定
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CMP羟甲基化酶MilA中与甲基羟化过程相关的关键氨基酸定点突变分析
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作者 高土玲 陈诚 +3 位作者 赵功 邓子新 胡申才 贺新义 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期50-57,共8页
【目的】米多霉素生物合成起始反应的MilA蛋白可以使底物胞苷酸单磷酸(CMP)的胞嘧啶碱基C5位上形成羟甲基化,形成羟甲基化胞苷酸(HmCMP),MilA是迄今发现的首个能够高效利用CMP的羟甲基化酶。MilA属于脱氧胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸... 【目的】米多霉素生物合成起始反应的MilA蛋白可以使底物胞苷酸单磷酸(CMP)的胞嘧啶碱基C5位上形成羟甲基化,形成羟甲基化胞苷酸(HmCMP),MilA是迄今发现的首个能够高效利用CMP的羟甲基化酶。MilA属于脱氧胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸羟甲基化酶(CH)蛋白超家族,通过三维结构预测发现它们的三维结构非常相似,CH94上的丝氨酸曾被证明与胞嘧啶上甲基变成羟甲基过程有关,MilA102上对应的氨基酸为苏氨酸,TS91上对应的氨基酸为脯氨酸。因此,突变MilA上第102位的苏氨酸,考察该氨基酸对CMP和脱氧胞苷酸(dCMP)羟甲基化反应的影响。【方法】通过定点突变技术,将MilA第102位的保守氨基酸苏氨酸(Threonine,T)分别点突变成缬氨酸(Valine,V)和亮氨酸(Leucine,L)。【结果】体外酶活实验结果显示,相对于MilA,MilA T102V对于CMP的催化活性下降87.1%,对于dCMP的催化活性没有影响;而MilA T102L均丧失了对于两种底物的活性。【结论】这表明Thr102对于MilA催化底物CMP形成HmCMP至关重要;同时,失去活性的仅比缬氨酸和野生型苏氨酸的链长多出了一个碳原子,暗示其在与底物结合时形成了一定的空间位阻效应。Thr在102位点的功能经过自然进化的微调有可能已经达到最优化。 展开更多
关键词 胞苷酸羟甲基化酶MilA 定点突变 脱氧胞苷酸羟甲基化酶 体外催化反应
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