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应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA
1
作者
张严
龚爱华
+2 位作者
金洁
邵根宝
彭琬昕
《江苏大学学报(医学版)》
CAS
2011年第5期390-393,401,共5页
目的:利用体外DNA同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体。方法:在引物5'加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T...
目的:利用体外DNA同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体。方法:在引物5'加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重组,转化并鉴定;将重组质粒转染293A细胞,免疫印迹鉴定目的基因的表达情况。结果:成功构建真核载体pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA,转染细胞后的表达产物相对分子质量分别是31×103和140×103。结论:与常规重组技术相比,体外DNA同源重组技术是一种高效的DNA重组方法,且不需考虑目的片段的限制性酶切位点。
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关键词
体
外
DNA
同源
重组
TRKA
神经生长因子
T4DNA聚合酶
下载PDF
职称材料
核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用
被引量:
3
2
作者
朱燕
韩小韦
+4 位作者
牛毅男
郑蓓
李学俊
徐全乐
陈鹏
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第5期827-836,共10页
核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Trun...
核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。
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关键词
核酸
外
切酶Ⅷ截短
体
表达纯化
体外同源重组
原文传递
题名
应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA
1
作者
张严
龚爱华
金洁
邵根宝
彭琬昕
机构
江苏大学基础医学与医学技术学院
出处
《江苏大学学报(医学版)》
CAS
2011年第5期390-393,401,共5页
基金
国家自然科学基金资助项目(30701031)
江苏省高校自然科学基金资助项目(07KJB310018)
江苏大学高级专业人才科研启动基金项目(09JDG072)
文摘
目的:利用体外DNA同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体。方法:在引物5'加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重组,转化并鉴定;将重组质粒转染293A细胞,免疫印迹鉴定目的基因的表达情况。结果:成功构建真核载体pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA,转染细胞后的表达产物相对分子质量分别是31×103和140×103。结论:与常规重组技术相比,体外DNA同源重组技术是一种高效的DNA重组方法,且不需考虑目的片段的限制性酶切位点。
关键词
体
外
DNA
同源
重组
TRKA
神经生长因子
T4DNA聚合酶
Keywords
homologous recombination in vitro
tyrosine kinase A
nerve growth factor
T4 DNA polymerase
分类号
R393 [医药卫生—基础医学]
下载PDF
职称材料
题名
核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用
被引量:
3
2
作者
朱燕
韩小韦
牛毅男
郑蓓
李学俊
徐全乐
陈鹏
机构
西北农林科技大学生命科学学院
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第5期827-836,共10页
基金
国家自然科学基金(Nos.30400282
31171606)
陕西省重点研发计划(No.2017NY-033)资助~~
文摘
核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。
关键词
核酸
外
切酶Ⅷ截短
体
表达纯化
体外同源重组
Keywords
truncated exonucleaseⅧ
expression and purification
homologous recombination in vitro
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA
张严
龚爱华
金洁
邵根宝
彭琬昕
《江苏大学学报(医学版)》
CAS
2011
0
下载PDF
职称材料
2
核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用
朱燕
韩小韦
牛毅男
郑蓓
李学俊
徐全乐
陈鹏
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
3
原文传递
已选择
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