骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

背景:间充质干细胞可通过分泌含细胞因子、生长因子和外泌体的细胞外囊泡调节肿瘤微环境,对肿瘤细胞生物学行为进行精准调控。目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过高速离心并过滤获得人脐带间充质干细胞条件培养基;收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过超高速梯度离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体。使用PKH26标记人脐带间充质干细胞外泌体,与肝癌细胞MHCC97-H共培养,荧光显微镜观察MHCC97-H细胞摄取外泌体情况。通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式凋亡实验评估人脐带间充质干细胞条件培养基、人脐带间充质干细胞外泌体对肝癌细胞生物学功能的影响。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞外泌体可被MHCC97-H细胞摄取且主要分布于细胞质中;(2)人脐带间充质干细胞条件培养基处理后,MHCC97-H细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.05,P<0.01),凋亡能力显著下降(P<0.001);而人脐带间充质干细胞外泌体处理后,MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P<0.001),迁移、侵袭及凋亡能力显著增强(P<0.001);(3)结果表明,人脐带间充质干细胞条件培养基具有促进MHCC97-H细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡的能力;而人脐带间充质干细胞外泌体则具有促进MHCC97-H细胞迁移、侵袭及凋亡和抑制增殖的能力。

白芨外泌体的分离及对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的凋亡保护研究

探索鲜白芨(Bletilla striata)外泌体对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的生物活性,为其在护肤品上的开发提供数据。聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌体,透射电镜鉴定,BCA法测蛋白浓度;细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)法检测Hacat细胞存活率,流式双染检测凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关通路蛋白。白芨外泌体呈茶杯状具双层膜,平均粒径69.63 nm,每克鲜白芨含外泌体浓度为5.24E+8 Particles,内含蛋白19.53μg;白芨外泌体(≥5μg/mL)可显著提高体外Hacat细胞存活率(P<0.05);10μg/mL白芨外泌体处理48h,可显著降低H_(2)O_(2)氧化造模引起的Hacat细胞早凋亡、晚凋亡和总凋亡的细胞比例(P<0.01),同时,模型组caspase-9和caspase-3表达显著上升,外泌体处理能显著降低其表达,而Bcl-2表达在组间无差异(P<0.05)。PEG沉淀法分离的白芨外泌体,可促进体外Hacat生长,抑制H_(2)O_(2)引起的细胞凋亡且与蛋白caspase-9和caspase-3相关。

健脾养正方调控肿瘤相关巨噬细胞外泌体诱导胃癌细胞失巢凋亡的机制研究

目的 探讨健脾养正方调控肿瘤相关巨噬细胞(TAM)外泌体对胃癌失巢凋亡的影响及其机制。方法 体外诱导人单核细胞THP-1建立TAM模型;超速离心法提取M0、TAM及TAM+健脾养正方外泌体,与胃癌细胞共孵育。流式细胞术检测各组外泌体对胃癌细胞失巢凋亡的影响。构建BALB/c移植瘤小鼠模型,Western blot检测移植瘤中凋亡蛋白的表达水平。Label-free质谱蛋白组学及生物信息学分析干预前后胃癌细胞中的差异蛋白;Western blot及qPCR实验检测差异蛋白异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)表达水平,泛素化实验检测IDH1的泛素化水平;试剂盒检测α-酮戊二酸(α-KG)、NADPH/NADP~+、谷胱甘肽(GSH/GSSG)水平及活性氧(ROS)含量。结果 TAM外泌体干预胃癌细胞后其失巢凋亡率降低(P<0.05,P<0.01);而TAM+健脾养正外泌体干预后则显著升高(P<0.05,P<0.01)。小鼠体内实验中,TAM外泌体组瘤体内Cleaved Caspase-3/Caspase-3的比值降低(P<0.05),而TAM+健脾养正方外泌体干预后比值明显增高(P<0.05)。蛋白组学分析显示IDH1在干预前后差异明显,且与三羧酸循环代谢相关。相较于M0组,TAM组外泌体干预的胃癌细胞IDH1泛素化水平升高,α-KG、NADPH/NADP~+及GSH/GSSG水平明显增加,ROS含量降低(P<0.05),而TAM+健脾养正外泌体则可逆转上述现象。结论 健脾养正方通过调控TAM外泌体使胃癌细胞IDH1发生泛素降解,降低胃癌细胞三羧酸循环代谢水平,促进ROS积累,诱发胃癌失巢凋亡,进而抑制胃癌发展。

补充褪黑素的人卵母细胞体外培养成熟技术在COH周期中的应用

目的比较同一控制性超促排卵(COH)治疗周期中,体内成熟与改良技术体外培养成熟(IVM)的卵母细胞的早期胚胎发育能力及临床结局,探讨补充褪黑素的IVM技术在临床中的应用。方法收集159例患者在COH周期中的920个成熟卵母细胞进行常规体外受精(IVF/ICSI)处理,同时收集同周期中1283个未成熟卵母细胞,在添加褪黑素的改良IVM培养基中培养成熟后行ICSI处理。通过回顾性分析,比较常规助孕技术与改良IVM技术这两种方式,对辅助生殖治疗的助孕结局和妊娠结局的影响。结果与从COH周期中收集到的行常规IVF/ICSI处理的成熟卵母细胞相比,经改良IVM技术促成熟的卵母细胞的优质囊胚形成率较低。但经胚胎移植后,两种方式获得的成熟卵母细胞的临床结局包括临床妊娠率、足月产率、婴儿体长、新生儿Apgar评分,差异均无统计学意义。结论IVM可以提高从COH周期中回收的未成熟卵母细胞的卵子利用率,改善辅助生殖技术助孕患者的妊娠结局。

枸杞外泌体对非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制和凋亡的调控作用

为阐明枸杞外泌体对非小细胞肺癌细胞A549的增殖抑制和凋亡的调控作用,通过超速离心法提取枸杞外泌体,通过透射电镜检测外泌体的形态,粒径分析检测外泌体的直径分布。用提取到的枸杞外泌体作用于A549细胞,通过CCK-8法检测枸杞外泌体对A549细胞的增殖影响,EdU检测枸杞外泌体对A549细胞的活性影响,细胞划痕、Transwell检测细胞的迁移效率,细胞克隆法检测细胞的克隆能力。流式细胞术检测细胞的凋亡率,用Western Blot和qRT-PCR法检测细胞凋亡通路的蛋白和基因表达。结果表明,提取的枸杞外泌体在电镜下呈茶托状,大小在40~200 nm,符合外泌体形状特征。与对照组相比,枸杞外泌体组能够浓度依赖性地抑制A549细胞增殖(P<0.01)。不同浓度枸杞外泌体处理组的细胞迁移能力和细胞克隆能力也呈浓度依赖性下降(P<0.01),而细胞凋亡率呈浓度依赖性增多(P<0.01)。枸杞外泌体能够浓度依赖性地上调Cl-Caspase3、p53、Bax等促凋亡因子,下调Bcl-2等抑凋亡因子的蛋白和基因(P<0.01)。结果表明,枸杞外泌体可以抑制A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡并且枸杞外泌体可通过线粒体通路诱导细胞凋亡。

脂肪间充质干细胞外泌体可减轻过氧化氢诱导PC12细胞的凋亡

背景:间充质干细胞外泌体在组织损伤修复中可能发挥关键作用,而miRNA是外泌体发挥治疗作用的重要成分,其中miR-29b-3p具有减少细胞凋亡、促进轴突再生和血管生成的作用。目的:研究脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p对过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型的保护作用,并探讨相关机制。方法:①首先采用胶原酶消化法提取大鼠脂肪间充质干细胞,通过miR-29b-3p模拟物及抑制物转染脂肪间充质干细胞,采用超速离心法从培养上清中提取外泌体并进行鉴定,从而构建高表达和敲低miR-29b-3p的脂肪间充质干细胞外泌体;②通过过氧化氢诱导PC12细胞模拟神经细胞损伤模型,研究脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p对神经元细胞损伤模型发挥保护作用的相关机制。结果与结论:①脂肪间充质干细胞外泌体具有典型的杯状形态,直径分布在50-140 nm范围内,表达外泌体表面特异性标志膜蛋白Alix、CD63及TSG101,并可被PC12细胞成功摄取;②脂肪间充质干细胞外泌体预处理可减轻过氧化氢诱导PC12细胞的凋亡,并且这种保护作用随着外泌体中miR-29b-3p表达的增加而增强,随着外泌体中miR-29b-3p表达的降低而减弱,其发挥作用的机制与脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达及抑制凋亡蛋白Bax的表达相关。

TGM2过表达的骨髓间充质干细胞外泌体抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡

目的探究转谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)过表达的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体在乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡中的作用及机制。方法选用20只6周龄雄性SD大鼠[体质量(350±50)g]用于提取髓核细胞。利用乳酸构建原代髓核细胞氧化应激性凋亡模型;利用慢病毒载体在BMSCs中过表达TGM2蛋白,提取外泌体并进行鉴定;后为验证TGM2过表达的外泌体抗髓核细胞氧化应激性凋亡潜在机制,利用流式细胞术对髓核细胞活性氧水平进行检测,Western blot、免疫荧光对髓核细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、磷酸化PI3K、磷酸化Akt、核内Nrf2、胞质Nrf2、HO-1蛋白表达水平及Nrf2核内荧光表达情况进行检测,分为4组(n=3):对照组、乳酸处理组、乳酸+对照外泌体组、乳酸+TGM2过表达外泌体组,评估髓核细胞的氧化应激性凋亡程度及PI3K/Akt/Nrf2通路变化情况。结果10 mmol/L乳酸能够更好的诱导髓核细胞氧化应激性凋亡(P<0.05);对照BMSCs组和TGM2过表达BMSCs组均可产生外泌体且能够稳定过表达TGM2(P<0.05,P<0.01);且相较于乳酸处理组,乳酸+TGM2过表达外泌体组和乳酸+对照外泌体组的髓核细胞均表现为凋亡率降低(P<0.05),活性氧水平下降(P<0.05),乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡、活性氧蓄积效果更好(P<0.05),髓核细胞内Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达均下降(P<0.05),Bcl-2蛋白水平均增高(P<0.05),PI3K、Akt磷酸化程度均增强(P<0.05),Nrf2核内表达均增加,抗氧化应激因子HO-1表达均增多,乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡及PI3K/Akt/Nrf2通路激活程度更强(P<0.05)。结论TGM2过表达的BMSCs外泌体可抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡,其机制可能与PI3K/Akt/Nrf2通路激活有关。

神经干细胞源性外泌体对脑缺血再灌注损伤后大鼠氧化应激和细胞凋亡的影响

目的探讨神经干细胞源性外泌体(NSC-Exos)对脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型大鼠氧化应激和神经细胞凋亡的影响。方法135只雄性SD大鼠随机分为Sham组(手术、不缺血、不微量注射)、MCAO组(手术、缺血、不微量注射)及NSC-Exos组(手术、缺血、侧脑室微量注射),于微量注射后大鼠脑缺血再灌注第1、7及14天时行神经功能缺陷评分,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)检测脑组织相对梗死体积,HE染色和透射电子显微镜观察海马CA3区神经细胞形态及亚显微结构,比色法检测海马组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量,Western blot检测海马组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与Sham组相比,MCAO组大鼠神经功能缺陷评分增高(P<0.05),脑组织相对梗死体积显著增大(P<0.05),神经细胞形态及超微结构受损严重,海马组织匀浆中GSH-PX、SOD酶活性降低,MAD含量增高(P<0.05),Bcl-2含量降低、Bax蛋白含量增加(P<0.05);与MCAO组相比,NSC-Exos组大鼠神经功能缺陷评分降低(P<0.05),脑组织相对梗死体积减小(P<0.05),存活神经细胞形态较为完好,超微结构较为清晰,海马组织匀浆中GSH-PX、SOD酶活性均增高,MAD含量减小(P<0.05),Bcl-2蛋白随缺血再灌注时间的延长表达增高,蛋白Bax表达减少(P<0.05)。结论NSC-Exos可改善MCAO大鼠的神经功能,减轻神经元的病理损伤,其机理可能与抑制海马组织的氧化应激和细胞凋亡有关。

miR-193b-3p过表达的HCT116外泌体对HUVEC增殖凋亡、迁移、血管形成影响及其与PAK4靶向关系

目的观察微小核糖核酸193b-3p(miR-193b-3p)过表达的人结直肠癌(CRC)细胞(HCT116)外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖凋亡、迁移、血管形成影响,并分析miR-193b-3p与p21活化蛋白激酶4(PAK4)的靶向关系。方法收集CRC患者血清和HCT116细胞上清外泌体,透射电镜实验和纳米颗粒示踪分析观察和鉴定外泌体,RT-q PCR实验检测外泌体miR-193b-3p和PAK4 m RNA。取人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并分组,PBS组加入100μL的PBS,HCT116-Exo组加入100μL的HCT116细胞外泌体,HCT116-Exo+GW4869组先用GW4869(10μmol/L)处理30 min,然后加入100μL的HCT116细胞外泌体,采用Ed U实验、Transwell实验和成管实验检测各组HUVEC细胞增殖、迁移和血管形成能力。取对数生长期的HUVEC细胞,并分为miR-NC组、miR-193b-3p组,miR-NC组与转染miRNA阴性对照(miR-NC)的HCT116细胞外泌体共培养,miR-193b-3p组与转染miR-193b-3p模拟物(miR-193b-3p mimics)的HCT116细胞外泌体共培养,采用CCK8实验、流式细胞术实验和成管实验检测各组HUVEC细胞活性、细胞周期、细胞凋亡和血管形成能力。双荧光素酶报告基因系统检测miR-193b-3p和PAK4的靶向关系。结果CRC患者血清和细胞外泌体miR-193b-3p表达升高,PAK4 m RNA表达降低(P均<0.05);CRC细胞外泌体可促进HUVEC细胞的增殖、迁移和血管形成(P均<0.05);过表达CRC细胞外泌体miR-193b-3p增加HUVEC细胞活力和血管形成、加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡(P均<0.05);miR-193b-3p直接靶向PAK4抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。结论CRC血清、癌细胞外泌体miR-193b-3p表达升高,加入HCT116细胞外泌体的HUVEC细胞增殖、迁移和血管形成能力增强,加入转染miR-193b-3p mimics HCT116细胞外泌体的HUVEC细胞增殖、S期占比、血管形成能力升高及G_(0)/G_(1)期占比、凋亡率下降,miR-193b-3p与PAK4存在靶向关系。

间充质干细胞外泌体联合ALR15mRNA减轻APAP引起的肝细胞凋亡

目的:探讨间充质干细胞外泌体(MSC-Exos)联合肝再生增强因子(ALR15)mRNA对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝细胞凋亡的影响。方法:通过NAT粒径检测、TEM电镜检测以及Western Blot鉴定提取的MSCExos。通过免疫荧光和Western Blot鉴定体外合成ALR15 mRNA。通过荧光染色、流式细胞术和Western Blot检测外泌体联合ALR15 mRNA对APAP引起的肝细胞凋亡的影响。结果:成功分离获得了MSC-Exos,并体外成功合成了ALR15 mRNA。外泌体联合ALR15 mRNA可进入肝细胞,通过抑制ROS的生成使APAP诱导的肝细胞凋亡减轻,且外泌体联合ALR15 mRNA比仅添加外泌体的抗凋亡效果更好。结论:MSC-Exos联合ALR mRNA可通过抑制ROS产生减轻APAP诱导的肝细胞凋亡,为干细胞外泌体联合ALR15 mRNA治疗APAP引起的肝细胞凋亡提供一个新的治疗思路。

川芎嗪预处理增强骨髓间充质干细胞外泌体对脑缺血大鼠的神经保护和抗神经元凋亡作用

[目的]探讨川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)预处理的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)源性外泌体(exosomes, Exos)对脑缺血大鼠的神经保护和抗神经元凋亡作用。[方法] TMP预处理BMSCs 48 h,采用超高速离心法分离提取外泌体并鉴定。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,实验分为假手术组、模型组、BMSCs源性Exos(BMSC-Exos)组和TMP预处理的BMSCs源性Exos(exosomes from TMP-pretreated BMSCs,TMP-BMSC-Exos)组。脑缺血90 min后,给药组分别经尾静脉注射BMSC-Exos(100μg/500μL)和TMP-BMSC-Exos(100μg/500μL)。采用Longa评分和角实验评价大鼠神经功能,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride,TTC)染色检测大鼠脑梗死体积,神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)和原位末端转移酶标记(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)免疫荧光双标检测神经元凋亡,免疫印迹法检测B细胞淋巴瘤-2 (B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bcl-2associated X,Bax)、磷酸化蛋白激酶B(phosphophorylated-protein kinase B,p-Akt)及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)的表达水平。[结果] BMSC-Exos和TMP-BMSC-Exos的形态、表面标记蛋白和粒径大小无显著差异。与BMSC-Exos比较,TMP-BMSC-Exos显著促进神经功能恢复(P<0.05),减小脑梗死体积(P<0.01),增加缺血周边区NeuN阳性细胞数量(P<0.05),减少凋亡神经元数量(P<0.05),提高Bcl-2和p-Akt蛋白表达水平,降低Bax蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。[结论] TMP预处理可以提高BMSC-Exos对脑缺血的神经保护作用,其机制可能与TMP-BMSC-Exos抑制神经元凋亡有关。

糖络宁通过外泌体调控IRE1α诱导细胞凋亡的作用机制研究

目的:探讨糖络宁(以下简称TLN)通过外泌体对雪旺细胞(schwann cells,SCs)IRE1α诱导的细胞凋亡的调控作用。方法:将30只SD大鼠分为空白组、模型组和糖络宁组,每组10只。除空白组外,其余各组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病模型。空白组及模型组灌胃给予蒸馏水,TLN组灌胃给予糖络宁溶液,12周后处死大鼠并收集血清。差速离心法分离血清中的外泌体,将SCs分为3组并分别与3组大鼠血清外泌体共培养。收集SCs,提取细胞中的总蛋白和总RNA,采用Western blot法测定TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax、Cyto C和cleaved-Caspase-3的蛋白表达,采用RT-PCR法测定ASK1和Caspase-9的mRNA表达。结果:与空白组比较,模型组TRAF2、p-JNK、Bax、Cyto C和cleaved-Caspase-3的蛋白表达显著升高,Bcl-2的蛋白表达显著降低,ASK1和Caspase-9的mRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,TLN组TRAF2、p-JNK、Bax、Cyto C和cleaved-Caspase-3的蛋白表达显著降低,Bcl-2的蛋白表达显著升高,ASK1和Caspase-9的mRNA表达显著降低(P<0.01)。结论:糖络宁能够通过外泌体抑制IRE1α-TRAF2-ASK1复合体,进而抑制JNK的磷酸化,然后分别抑制Bax表达,促进Bcl-2表达,以及抑制Cyto C、Caspase-9和Caspase-3的表达,从而抑制细胞凋亡。

病毒性心肌炎血清外泌体来源的miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡

目的探讨病毒性心肌炎血清外泌体miR-320对心肌细胞凋亡的影响及机制。方法使用柯萨奇病毒B3(CVB3)腹腔注射,建立病毒性心肌炎小鼠模型;采用血清外泌体抽提试剂盒提取血清外泌体,与心肌细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察心肌细胞摄取外泌体情况;使用miR-320抑制剂或模拟物转染心肌细胞,实时荧光定量PCR检测miR-320表达水平;采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(BAX)表达水平;生物信息学预测miR-320靶基因并进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析;荧光素酶报告基因检测miR-320与其靶基因磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1(Pik3r1)的作用关系;Western blot法检测miR-320对蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)通路蛋白的影响。结果病毒性心肌炎血清外泌体促进心肌细胞凋亡并上调BAX水平,同时降低Bcl2水平;病毒性心肌炎小鼠心肌组织中miR-320显著上调,且miR-320成熟体和miR-320前体pri-miR-320表达在心肌细胞均明显上调;病毒性心肌炎血清外泌体处理的心肌细胞中miR-320水平显著上调,而转染miR-320抑制剂逆转了外泌体引起的miR-320上调及凋亡率升高;Pik3r1是miR-320的靶基因,其过表达逆转miR-320上调导致的心肌细胞凋亡;miR-320过表达抑制AKT/mTOR通路激活。结论病毒性心肌炎血清外泌体miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡。

基于miR-153/TREM1探讨健神利水方对脑出血大鼠神经细胞凋亡的作用机制

目的探究健神利水方对脑出血大鼠神经细胞凋亡的作用机制。方法通过miRNA微阵列芯片和RT-PCR分析出脑出血中miR-153的表达,观察并分析miR-153与脑出血神经细胞凋亡关系;预测miR-153的靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验观察其与靶基因的结合情况,观察过表达和抑制miR-153对靶基因的影响,随后,明确靶基因与脑出血神经细胞凋亡关系,最后观察健神利水方对miR-153、靶基因的影响,最终探究健神利水方对脑出血大鼠神经细胞凋亡的相关机制。结果微阵列芯片和RT-PCR检测表明miR-153在脑出血中是低表达的(P<0.05),miR-153与神经细胞凋亡呈负相关(R:-0.875,P=0.0002)。在线数据库TargetScan和miRDB显示miR-153与TREM1具有结合区域,双荧光素酶报告基因实验证明两者具有结合关系,当miR-153过表达时,TREM1表达量会下调,相反,当miR-153抑制时,TREM1表达量会上调,TREM1与神经细胞凋亡呈正相关(R:0.857,P<0.001)。健神利水方组的TREM1表达量、神经细胞凋亡数量、神经功能缺损评分均低于模型组(P<0.05),miR-153表达量高于模型组(P<0.05)。健神利水方+miR-153抑制组的TREM1表达量、神经细胞凋亡数量、神经功能缺损评分均高于健神利水方组(P<0.05)。结论健神利水方通过促进miR-153表达,抑制TREM1表达来达到抑制脑出血大鼠神经细胞凋亡,保护神经功能。

骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

背景:研究表明,抑制内质网应激所致的细胞凋亡能够挽救神经部分功能。茶多酚能抑制内质网应激,但是存在生物利用率差不易透血脑屏障等问题,结合外泌体靶向脊髓修复及高效载药,理论上两者结合能够发挥更优的脊髓保护效能。目的:探讨茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体对脊髓缺血再灌注损伤大鼠神经功能及内质网应激的影响。方法:SD雄性大鼠50只,随机分为假手术组、模型组、茶多酚组、外泌体组、联合治疗组,每组10只,除假手术组外,其余4组制作脊髓缺血再灌注损伤模型,术后2 h经尾静脉注射生理盐水、外泌体、茶多酚、茶多酚+骨髓间充质干细胞外泌体混合液;脊髓损伤后7,14,28 d进行BBB神经功能评分,脊髓损伤后14 d,取脊髓组织进行苏木精-伊红染色、尼氏染色、ATF6和GADD153内质网应激标志物免疫荧光染色。结果与结论:①神经功能评分:与假手术组比较,模型组、外泌体组、茶多酚组、联合治疗组神经功能评分均不同程度下降,术后14 d联合治疗组神经功能评分优于茶多酚组、外泌体组、模型组(P<0.05),术后28 d后联合治疗组神经功能评分优于模型组和茶多酚组(P<0.05);②苏木精-伊红染色和尼氏染色显示:模型组大鼠神经元细胞数量减少,脊髓损伤区域内大量空洞坏死及瘢痕增生,茶多酚组、外泌体组、联合治疗组神经元数量和周边空洞坏死有不同程度改善,联合治疗组改善最为明显;③内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达:术后14 d联合治疗组GADD153表达低于模型组和茶多酚组(P<0.05),联合治疗组ATF6表达低于模型组、外泌体组和茶多酚组(P<0.05);④结果表明:茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体能改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,可能与抑制内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达有关。

体外培养软骨细胞凋亡与caspase-3表达的实验研究

目的 探讨软骨细胞体外培养过程中凋亡发生以及 caspase- 3的表达。 方法 采用 Annexin 和TU NEL 法检测第 1～ 4代软骨细胞在体外正常培养体系中第 3天和第 7天的凋亡率 ;RT- PCR和 Western blot分析caspase- 3表达水平 ;EL ISA检测 caspase- 3蛋白酶活性。 结果 第 1～ 4代软骨细胞在体外培养过程中均存在不同程度的凋亡现象 ,各代次软骨细胞第 7天的凋亡率 15 .7%± 0 .3% ,明显高于第 3天的 8.9%± 0 .6 % ,有统计学意义 (P<0 .0 1)。caspase- 3m RNA和蛋白质在整个培养过程中都有表达 ,随着时间延长表达上调 ,第 7天的表达水平高于第 3天。体外培养 7天后 caspase- 3被激活 ,可检测到分子量为 2 0 ku的裂解片段。caspase- 3蛋白酶活性随着培养时间延长也逐渐增高 ,与细胞凋亡程度基本一致。 结论 软骨细胞在体外培养过程中存在凋亡 ,caspase- 3参与了凋亡事件并发挥着重要作用。

ABT-737对M2型TAM来源外泌体处理的卵巢癌细胞SKOV3自噬性凋亡与干性特征的影响

目的探讨Bcl-2小分子抑制剂ABT-737对经肿瘤相关巨噬细胞(TAM)来源外泌体(Exo)处理的卵巢癌细胞自噬性凋亡及干性特征的作用。方法利用佛波酯(PMA)与重组人白细胞介素-4(IL-4)诱导人外周血单核细胞THP-1为M2型TAM,流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞相关标志物表达;差速离心法提取外泌体,透射电镜与纳米粒子追踪技术观察外泌体形态及径粒分布,Western blot检测外泌体标志蛋白表达,Dil结合PKH67染色检测TAM来源外泌体被卵巢癌细胞系SKOV3摄取情况;实验分组为对照组、Exo组、Exo+ABT-737组,采用TAM来源外泌体与ABT-737按照分组处理SKOV3细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,双荧光mRFP-GFP-LC3实验检测细胞自噬水平,Western blot检测细胞自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、p62)与凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3)表达,肿瘤细胞成球实验检测细胞干性,Western blot检测肿瘤干细胞相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2)表达。结果经PMA与IL-4诱导后,THP-1细胞形态发生改变,M1型巨噬细胞标记物CD86表达比例降低而M2型巨噬细胞标记物CD206表达比例升高(P<0.05)。分离的颗粒物为球形囊泡,大小均匀,粒径峰值约为140 nm,外泌体标志蛋白Alix、CD63、TSG101表达明显,由此判断成功分离到M2型TAM来源Exo,且其能被SKOV3摄取。与对照组比较,Exo组SKOV3细胞凋亡率减少,GFP与mRFP的荧光斑点减少,细胞内LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、Bax及Cleaved-caspase3表达均下调,p62与Bcl-2表达均上调,此外,细胞成球数量增加,CD133、OCT4及SOX2表达均上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与Exo组比较,Exo+ABT-737组SKOV3细胞凋亡率增加,GFP与mRFP的荧光斑点也增加,细胞内LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、Bax及Cleaved-caspase3表达均上调,p62与Bcl-2表达均下调,细胞成球数量减少,且CD133、OCT4及SOX2表达均下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论ABT-737能够在M2型TAM来源外泌体处理的卵巢癌细胞中发挥促自噬性凋亡的作用,并且可以抑制卵巢癌肿瘤干性特征。

hUC-MSCs来源的外泌体miR-1260a影响PCOS患者颗粒细胞凋亡的研究

目的探究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)来源的外泌体miR-1260a靶向CASP8对多囊卵巢综合征(PCOS)患者颗粒细胞凋亡的影响。方法取健康足月胎儿的脐带进行组织块贴壁法分离培养获得hUC-MSCs,采用流式细胞仪检测其标志性蛋白CD73和CD90的表达。收集hUC-MSCs培养上清液,提取hUC-MSCs外泌体,透射电镜观察其形态,Western blot检测外泌体膜表面标志物热休克蛋白70(HSP70)和肿瘤易感基因101(TSG101)的表达。PKH67标记外泌体,采用激光共聚焦显微镜观察PCOS颗粒细胞对外泌体的内化作用。Western blot检测hUCMSCs外泌体对PCOS颗粒细胞凋亡的影响。利用GSE69909临床样本进行生物信息学分析,得到hUC-MSCs外泌体中异常高表达的miRNAs,并通过实时荧光定量PCR进行验证。合成miR-1260a模拟物及其对照转染至KGN细胞中,流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。利用Target Scan Human 7.2数据库进行miR-1260a靶基因的预测,采用双荧光素酶报告基因系统检测miR-1260a对靶基因的调控作用。qPCR检测PCOS颗粒细胞摄取hUC-MSCs外泌体前后miR-1260a及CASP8的表达情况。结果经鉴定所培养的细胞符合hUC-MSCs的特征,hUC-MSCs外泌体为直径30~150 nm的圆形或椭圆形囊泡状结构,表达标志物蛋白HSP70和TSG101,并且可被PCOS颗粒细胞摄取。与对照组相比,hUC-MSCs上清液处理组及hUC-MSCs外泌体处理组Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达显著下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著上调(P<0.05)。经GSE69909数据库筛选及qPCR验证发现miR-1260a在hUC-MSCs外泌体中富集,miR-1260a过表达可显著抑制颗粒细胞的凋亡(P<0.05),经验证miR-1260a可直接靶向CASP8且PCOS颗粒细胞摄取hUC-MSCs外泌体后,颗粒细胞中miR-1260a的表达升高,CASP8的表达降低(P<0.05)。结论hUC-MSCs来源的外泌体miR-1260a通过靶向CASP8抑制PCOS颗粒细胞凋亡。

白藜芦醇对体外培养的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞周期与凋亡的影响

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对体外培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞周期与凋亡的影响。方法:通过不同浓度0.5～150μmol/L Res作用于体外培养的SH-SY5Y,72 h后用流式细胞术检测细胞周期构成比和细胞凋亡率,用Hochest染色观察细胞凋亡情况。结果:0.5～5μmol/L各组,进入G2/M期细胞所占活细胞比率逐渐升高;5～150μmol/L各组,随浓度升高,凋亡率呈现逐渐上升的趋势,而且显著高于对照组(P<0.01),其中150μmol/L组凋亡率为51.80±1.72%,进入G0/G1期间细胞为78.54±0.60%,显著高于对照组(P<0.01),而进入G2/M期细胞为0.48±0.50%,即大多细胞停留于DNA复制前期。结论:Res在0.5～150μmol/L浓度范围内对SH-SY5Y具有双向浓度依赖性,即在0.5～5μmol/L浓度范围内,Res促进SH-SY5Y细胞增殖,而在15～150μmol/L浓度范围内Res抑制SH-SY5Y细胞增殖并促进其凋亡;其中Res抑制SH-SY5Y细胞增殖并促进凋亡主要表现为阻止G1期细胞进入S期。