体外培养自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉11例

目的:观察体外培养自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的临床效果。方法:翼状胬肉11例12眼采取显微镜下手术切除局部病灶联合体外培养自体角膜缘干细胞移植术,术后随访6～15(平均10)mo。结果:术后角膜上皮愈合良好,无排斥反应或其它并发症发生。随访期间1眼复发,复发率为8%。结论:体外培养自体角膜缘干细胞移植术为受损的角膜缘提供新的健康干细胞,可有效地防止翼状胬肉复发,简单、安全、有效。

自体角膜缘干细胞移植与自体体外培养角膜干细胞移植治疗翼状胬肉临床观察

目的:探讨自体角膜缘干细胞移植与自体体外培养角膜干细胞移植治疗翼状胬肉的疗效。方法:对26例27眼翼状胬肉患者进行显微镜下翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植或自体体外培养角膜干细胞移植术。结果:自体角膜缘干细胞移植和自体体外培养角膜干细胞移植治疗翼状胬肉,术后均表现为不适症状轻持续时间短,角膜创面愈合快,随访1～2a两种术式各复发1眼,治愈率为93%和92%。结论:自体角膜缘干细胞移植与自体体外培养角膜干细胞移植均可有效防止翼状胬肉的复发,对复发性翼状胬肉和角膜缘损伤的患者自体体外培养角膜干细胞移植更为安全有效。

人角膜缘干细胞在体外不同载体上培养的实验研究

目的 寻找人角膜缘干细胞体外培养的载体。方法 人角膜缘干细胞原代培养单细胞层传代到羊膜、卵壳膜、聚乳酸膜、藻酸盐凝胶４种载体和６孔培养板中，倒置显微镜观察、记录细胞生长情况。对６孔板传代细胞行生物特性检测，对载体上培养细胞行组织学检测。结果 ６孔板中传代细胞对 ＡＥ－５，４ Ｇ１０．３表达阳性。羊膜、卵壳膜和聚乳酸膜上有细胞生长，７天左右形成单层；藻酸盐凝胶载体上未见细胞生长。结论 传代细胞具有角膜缘干细胞生物特性；羊膜、卵壳膜和聚乳酸膜适合角膜缘干细胞传代培养。

兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液对兔角膜缘于细胞行体外培养,观察细胞贴壁生长情况;同时对生长良好的原代细胞进行消化传代,进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组,角膜缘干细胞在培养48-72 h有 80％贴壁生长,7-10天形成良好单层,细胞呈圆形。卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;传代培养细胞形态仍正常,生长良好,但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72 h,仅有 20％细胞贴壁生长,巨细胞形态极不规则,有细胞“拉网”现象,培养 14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难,需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。

兔角膜缘干细胞体外壳聚糖共混膜上培养的形态学观察

目的 探讨壳聚糖作为兔角膜缘干细胞体外培养载体的可行性。方法 应用消化培养法在壳聚糖材料上对兔角膜缘细胞进行原代培养 ,倒置显微镜观察细胞生长情况 ,并在电子显微镜下观察壳聚糖的结构以及第 7d时细胞的形态。结果 壳聚糖呈现三维多孔结构相互连接成网状 ,孔径直径大小约 90 μm ,其上有细胞生长 ,7d左右形成单层次 ,9d后细胞培养开始出现老化现象。结论 壳聚糖上可成功地对兔角膜缘组织进行原代培养 ,可用作组织工程角膜的载体材料。

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性。方法用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点。结果培养2～3d细胞从组织块游出,6～8d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形。电镜观察,培养7dLSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象。免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7d:184.30±9.85,14d:133.36±25.00,P<0.01)。P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7d:108.13±17.96,14d:177.59±7.86,P<0.01)。结论应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期。

兔角膜缘干细胞体外分离、培养和生物学鉴定的实验研究

通过体外培养兔角膜缘干细胞,观察其生物学特性,建立兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法0．25%胰蛋白酶消化角膜缘组织,用含15%胎牛血清的DMEM和F12(1:1)的培养液(DF)对兔角膜缘干细胞进行体外培养,形态学观察,培养的细胞早期使用AEl/AE3、晚期使用AE5角蛋白特异的单克隆抗体)作细胞免疫化学鉴定。结果:原代培养细胞48h后开始贴壁,部分细胞由圆形变为卵圆形或长梭形;10～14d形成单层,细胞呈圆形、卵圆形,类角膜上皮细胞;细胞传到第5代左右开始出现老化状态;免疫细胞化学染色:培养的细胞早期AEl/AE3呈阳性而少部分细胞AE5呈阳性,培养的细胞晚期AE5呈阳性。结论:本实验初步建立了一套兔角膜缘干细胞的体外培养方法。

人角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨人自体角膜缘干细胞(LSCs)体外培养及鉴定的方法。方法将供体新鲜人角膜缘组织在制备的含20%胎牛血清DMEM/F12培养基的羊膜载体上应用组织块培养法进行体外培养,对培养获得的LSCs用苏木精-伊红染色在倒置显微镜下进行形态学观察,用免疫荧光技术鉴定培养的LSCs细胞。结果组织块静置2h后贴壁良好,3～4d细胞从组织块边缘萌出,7～10d细胞出现生长高峰,12～14d形成良好的细胞单层。细胞形态呈多边形、圆形、卵圆形和梭形。第14天时行间接免疫荧光染色,可见大量细胞表达p63,呈细胞质的绿色荧光;少量细胞表达AE5,呈细胞质的绿色荧光和细胞核的红色荧光。结论组织块培养法体外培养的人LSCs具有与正常人LSCs相一致的生物学特性。

人角膜缘干细胞体外培养的增殖与分化研究(英文)

目的了解角膜缘干细胞体外培养的增殖分化规律。方法组织块法培养细胞，测定细胞克隆形成率（ＣＦＥ），免疫荧光染色检测干细胞表达角质蛋白Ｋ３的状况。结果原代培养２１天左右细胞生长达到饱和，传第１代７～１０天形成单层，ＣＦＥ为９．５２％±４．９７％；传第２代７天，ＣＦＥ为４．２５％±２．１０％（Ｐ＜０．０１）。正常角膜缘基底细胞不表达角质蛋白Ｋ３；原代培养的干细胞亦不表达Ｋ３，传第１代细胞有部分表达。结论人角膜干细胞位于角膜缘基底部，培养的角膜缘干细胞早期具有较高的增殖力并保持干细胞的分化特性。

人角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立人角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20%胎牛血清1640培 养液对人角膜缘干细胞进行体外培养,进行形态学观察和免疫细胞化学鉴定。结果 植块3～4d后细胞开始贴壁 生长,10～15d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形,类角膜上皮细胞;免疫细胞化学染色显示,培养第11d,少量 细胞表达AE5,大量细胞表达p63。结论 应用20%胎牛血清1640培养液组织培养的方法获得的原代培养细胞具 有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。

自体角膜缘干细胞的培养移植(英文)

目的:自体角膜缘干细胞培养后自体移植被认为是眼表疾病的最佳治疗方法,因此,有必要深入认识角膜缘干细胞分子生物学的特征、组织学解剖和微环境以及自体角膜缘干细胞移植方面的研究进展。资料来源:应用计算机检索Medline1995-01/2002-12的文章,检索词“limbuscorneae,stemcells,autotransplant”,限定文章语言种类为Eng-lish;同时检索http://www.wanfangdata.com.cn1995-01/2002-12的文章,检索词“角膜缘干细胞,自体移植”,限定文章语言种类为中文。资料选择:选择与角膜缘干细胞组织学、生理病理学研究的相关及自体角膜缘干细胞培养移植相关文献进行初审。纳入标准:①动物实验研究。②临床观察应用研究。排除标准:①重复研究。②综述文献。资料提炼:共收集到120多篇上述相关文献。选择符合标准的15篇文章进行综合分析。资料综合:①角膜缘干细胞分子生物学的特征:角膜上皮干细胞具有其他定向干细胞相似的特性,有很强的增殖和细胞分裂能力;处于低分化状态;细胞周期长;分裂不对称。②角膜缘干细胞组织学解剖:在角膜缘基底部的Vogt栅栏区乳头状结构中的某些基底细胞即是角膜缘干细胞。③角膜缘干细胞与微环境:干细胞的增生和分化受到血清来源的因素及多种细胞因子的调控,因此,微环境中因素的变化直接影响着角膜缘干细胞的增生分化,从而导致各种角膜损伤性疾病的发生。④自体角膜缘干细胞移植:将严重眼表疾病患者健眼的自体角膜缘干细胞培养到羊膜载体上进行自体患眼眼表移植。观察术后2～5d内角膜上皮即可再生,1个月后视觉灵敏度明显增加,术后观察4个月,可见角膜上皮完整性以及持续性新生血管消退。结论:自体角膜缘干细胞培养后移植尚处于实验研究阶段,其中自体角膜缘干细胞培养后移植治疗眼表疾病已初步获得成功,然而这种移植术后远期疗效需进一步临床观察。培养后的角膜缘上皮干细胞增殖、分化,生理、生化和免疫特性的变化及移植的载体、移植后细胞的移行、黏附、增殖和分化能力等问题,以及对于干细胞独特的单克隆抗体的筛选,干细胞的纯化与体外培养,如何控制干细胞的分化及细胞因子对干细胞的影响等都尚待需进一步研究。对没有任何自体角膜缘干细胞来源双眼伤患者可否行同种异体角膜缘干细胞培养后移植?是否通过培养角膜缘干细胞的抗原性可能发生改变从而降低排斥反应的发生率?这将是最有前途的发展方向。

自体角膜缘干细胞培养移植研究进展

随着角膜缘干细胞概念的确立 ,临床和实验证实角膜上皮干细胞位于角膜缘 ,角膜上皮病变是由于角膜缘干细胞功能缺陷或数量不足而引起 .解决这些角膜疾病的根本方法是采取含有角膜缘干细胞的组织移植术 .目前认为最有前途的治疗方法应是自体角膜缘干细胞培养后自体移植 .

穿透性角膜移植联合体外培养的角膜缘干细胞移植治疗严重角膜病变

对于角膜缘受损或功能不良,同时伴有角膜全混的角膜疾病,单纯的穿透性角膜移植术疗效不理想。近年来,人们开始探讨穿透性角膜移植联合体外培养的角膜缘干细胞移植的可行性,本文将就相关研究作一较为详尽的综述。

不同诱导剂对体外角膜缘干细胞培养的影响

眼表重建常用的羊膜移植或自体角膜缘干细胞移植的方法,对眼表组织损伤过大,且对眼表自身干细胞缺乏者临床效果较差.我们常采用体外培养自体角膜缘干细胞后联合生物载体进行眼表移植重建.本实验对兔角膜缘干细胞进行体外培养,观察不同的诱导环境对干细胞最终的繁殖分化的影响.

体外传代培养的角膜缘干细胞特性的研究

目的探讨体外培养的角膜缘干细胞的特性并寻找其表面标志。方法体外扩增人角膜缘干细胞,检测第4代培养细胞Brd-U掺入率及p63、connexin43、角蛋白3/12的表达情况,分析细胞表面分子的表达。结果培养细胞Brd-U24h掺入率明显低于6d掺入率;第4代细胞表现为p63单阳、p63-connexin43双阳和角蛋白3单阳的混合体,而角膜上皮细胞只表达角蛋白。流式细胞分析传代的干细胞β4integrin,CD90(+),α6integrin,CD14(-),角膜上皮细胞CD14(+)。结论体外传代培养的角膜缘干细胞部分保持干细胞特性,具有增生能力。p63是增生细胞的标志。β4integrin+/α6integrin-联合CD90+/CD14-可能纯化角膜缘干细胞。

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性.方法用含20%胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定.结果植块48～72 h细胞开始贴壁生长,7～10 d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞AE5免疫反应阳性.结论含20%胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液.应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性.

兔角膜缘干细胞的体外低钙原代培养研究

目的:探讨获取较纯的体外培养的兔角膜缘干细胞的方法,为角膜缘干细胞的临床移植奠定实验基础。方法:采用低钙培养法对兔角膜缘组织行体外培养,观察培养细胞的分化状态,并将培养的细胞行AE5免疫荧光染色。结果:体外培养的细胞以未分化的角膜缘干细胞为主。结论:取用角膜缘基底组织进行培养,将无钙培养液与低钙培养基结合,可获得较纯的、未分化的角膜缘干细胞。