骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

骨质疏松环境下骨髓间充质干细胞外泌体通过OPG/RANKL调控破骨分化

目的:绝经后骨质疏松PMOP(postmenopause osteoporosis)是一种慢性炎症性疾病,破骨细胞的异常活化是发病的重要原因之一。病理环境下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)外泌体对破骨细胞的作用及影响尚不明确。本研究分析了PMOP环境下,BMSCs外泌体(exosome,Exo)对破骨细胞分化的调控作用,对于明确骨质疏松的发病机制具有至关重要的意义。方法:分别从正常和绝经后骨质疏松患者骨髓中提取BMSCs,通过超速离心联合Exoquick试剂盒分别提取两种细胞的Exo,即正常BMSCs外泌体(healthyExo,H-Exo)和绝经后骨质疏松骨髓间充质干细胞外泌体(postmenopause osteoporosis-Exo,P-Exo),并通过透射电子显微镜(TEM),纳米颗粒示踪分析技术(NTA)、Western blot对分离的外泌体进行鉴定;两种不同的外泌体被引入RAW264.7细胞中,以便通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western blot分析和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色来评估RAW264.7细胞中破骨分化相关指标的表达。同时,使用Western blot和ELISA方法来测定这两种外泌体中OPG/RANKL蛋白的表达水平。实验数据通过SPSS 24.0软件进行统计分析。结果:对提取后的两种外泌体进行形态学比较发现,与H-Exo相比,P-Exo直径更大,P-Exo能够促进RAW264.7细胞破骨分化标志性基因NFATC1和Trap mRNA及蛋白的表达,Trap染色可见分化的破骨细胞,Western blot及ELISA检测两种外泌体OPG/RANKL的表达发现,与H-Exo相比,P-Exo内OPG的表达量下降,而RANKL表达量升高。结论:绝经后骨质疏松中骨吸收增加,可能是炎症微环境下,BMSCs外泌体通过传递RANKL,促进破骨细胞分化引起的。此项研究为深入研究骨质疏松病因的开辟了新的途径,并为骨质疏松的治疗提供了新的治疗靶点。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

骨髓间充质干细胞外泌体通过PI3K/Akt通路修复大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞外泌体(exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs-Exos)通过PI3K/Akt通路修复皮瓣缺血再灌注损伤的机制。方法培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),提取细胞上清液中的外泌体并通过电镜、粒径分析及免疫印迹实验进行鉴定。建立以腹壁浅动静脉为血管蒂的大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤模型;将大鼠随机分为4组:Sham组、IR+PBS组、IR+Exo组及IR+Exo+LY组。术后观察并拍照记录大鼠皮瓣大体情况,第7天计算皮瓣坏死区比例;获取大鼠皮瓣组织样本,HE染色和组织评分评估皮瓣组织损伤程度,免疫组化评估皮瓣p-Akt、VEGFA表达水平和CD34标记的微血管密度。结果相比Sham组,IR+PBS组皮瓣坏死区比例增加,组织结构破坏加重,p-Akt及VEGFA表达水平下降,微血管密度降低;IR+Exo组皮瓣坏死和组织破坏水平降低,p-Akt及VEGFA表达上升,微血管密度增加;而PI3K抑制剂降低了BMSCs外泌体的修复作用,表现为皮瓣坏死增加,p-Akt及VEGFA表达下调,微血管密度减少。结论BMSCs外泌体对大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤具有显著的保护和修复作用,PI3K/Akt信号通路可能是BMSCs外泌体治疗皮瓣缺血再灌注损伤的关键通路。

骨髓间充质干细胞源外泌体保护顺铂相关急性肾损伤作用及机制研究

目的:探索骨髓间充质干细胞源外泌体(BMSC-exos)保护顺铂(CDDP)诱导急性肾损伤(AKI)作用及机制。方法:48只C57BL/6小鼠随机分4组:对照(CN)组、顺铂诱导AKI模型(CDDP)组、CDDP+BMSC-exos(CDDP+EXO)组、CDDP+BMSC-exos+PI3K抑制剂(LY294002)(CDDP+EXO+LY294002)组。分别腹腔、尾静脉注射生理盐水、顺铂、顺铂+BMSC-exos及顺铂+BMSC-exos+LY294002。留取血液测肌酐(SCr)和尿素氮(BUN);取肾组织进行病理分析;TUNEL观察肾小管上皮细胞(RTEC)凋亡;免疫组化染色检测活化的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、葡萄糖调节蛋白78(GRP-78)、半胱氨酸蛋白酶12(caspase-12)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达定位;Western Blot法测定Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12、CHOP、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)表达。结果:在CDDP诱导AKI模型中,肾组织TUNEL阳性细胞数目明显增多(P<0.05),免疫组化免疫Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12和CHOP阳性面积显著增加(P<0.05),Western Blot法证实,Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12及CHOP表达水平显著上调(P<0.05),p-AKT表达水平显著下调(P<0.05)。经BMSC-exos治疗,肾组织TUNEL阳性细胞数目明显减少(P<0.05),免疫组化染色Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12和CHOP阳性面积显著减少(P<0.05),Western Blot法证实,Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12及CHOP表达水平显著下调(P<0.05),p-AKT表达水平显著上调(P<0.05)。BMSC-exos治疗前应用LY294002治疗,肾组织TUNEL阳性细胞数目明显增多(P<0.05),免疫组化免疫Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12和CHOP阳性面积显著增加(P<0.05),Western Blot法证实,Cleaved caspase-3、GRP-78、caspase-12及CHOP表达水平显著上调(P<0.05),p-AKT表达水平显著下调(P<0.05)。结论:BMSC-exos保护CDDP-AKI作用机制可能是通过抑制内质网应激及激活PI3K/AKT信号通路。

过表达miR-486-5p的骨髓间充质干细胞通过外泌体来保护缺氧损伤心肌细胞

目的探讨过表达miR-486-5p小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)来源外泌体(Exo)对缺氧损伤心肌细胞的影响及机制。方法通过慢病毒转染来构建过表达miR-486-5p的小鼠BMSC。提取转染成功的BMSC所分泌的Exo,包括空载体BMSC分泌的Exo(Exo-NC)、miR-486-5p过表达BMSC分泌的Exo(Exo-miR-486)及未处理BMSC分泌的Exo(Exo-Control)。取12~18 d胎鼠原代心肌细胞,将其分为常氧培养组(Normoxia组)、缺氧培养组(Hypoxia组)、Hypoxia+Exo-NC组及Hypoxia+Exo-miR-486组,并给予不同时间的缺氧处理来模拟心肌细胞缺氧状态,检测细胞增殖状态、凋亡率,以及活性氧(ROS)、核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)和裂解的胱天蛋白酶-1(cleaved caspase-1)的表达水平。结果Hypoxia组心肌细胞增殖能力低于Normoxia组,而凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表达水平均高于Normoxia组(P<0.05);Hypoxia+Exo-NC组心肌细胞增殖能力高于Hypoxia组,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表达水平低于Hypoxia组(P<0.05);Hypoxia+Exo-miR-486组心肌细胞增殖能力高于Hypoxia+Exo-NC组,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1表达水平低于Hypoxia+Exo-NC组(P<0.05)。结论来自miR-486-5p过表达BMSC的Exo能减少缺氧导致的ROS的产生及其引起的心肌细胞凋亡,并改善缺氧引起的心肌细胞增殖缓慢的问题。

人骨髓间充质干细胞及其外泌体在肝移植术后肝缺血再灌注损伤中潜在治疗作用的研究进展

肝缺血再灌注损伤(HIRI)是传统肝移植术中不可避免的病理生理过程,其严重程度受到来自供体和受体的多方面因素影响,最严重者可导致术后早期移植肝无功能。人骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其外泌体已在临床试验中被证实具有促进组织修复与免疫调节的能力,这一治疗作用在HIRI的防治中具有较好的应用前景。该文旨在综述BMSCs及其外泌体在移植肝HIRI防治中潜在作用机制的研究进展及未来研究方向。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过PI3K/AKT信号通路逆转高糖诱导的骨髓间充质干细胞成骨功能障碍

目的:探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMSCs-EXOs)对高糖诱导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨功能障碍的作用和机制。方法:利用超速离心法从BMSCs中提取外泌体,并通过透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子追踪分析(NTA)、Western blot等方法来评估其特征。用高糖培养基模拟高糖微环境,通过DCFH-DA荧光探针、Western blot、细胞免疫荧光技术(IF)、碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色(ARS)等技术来研究BMSCs-EXOs对高糖诱导的BMSCs氧化应激水平、成骨分化和矿化能力的影响。另外,通过PI3K通路阻断剂(LY294002)抑制PI3K磷酸化表达,研究BMSCs-EXOs是否通过激活PI3K/AKT信号通路影响BMSCs的成骨分化和矿化能力。结果:通过TEM、NTA和Western blot可评估从BMSCs中成功提取到的外泌体。与Control组比,HG组氧化应激水平显著升高(P<0.05),HO-1、NQO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),ALP、ARS活性明显降低(P<0.05),COL1A1、RUNX2、BMP2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与HG组比,HG+EXOs组氧化应激水平明显降低(P<0.05),HO-1、NQO-1蛋白表达水平上调(P<0.05),ALP、ARS活性增加(P<0.05),COL1A1、RUNX2、BMP2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平上调(P<0.05)。当加入LY294002后,PI3K/AKT信号通路的的磷酸化表达受到了明显的抑制,并且BMSCs-EXOs的促成骨作用也随之受到了明显的减弱(P<0.05)。结论:BMSCs-EXOs通过降低高糖诱导的氧化应激水平,部分恢复了BMSCs的成骨分化和矿化能力,这种促成骨作用可能通过PI3K/AKT信号通路实现的。

骨髓间充质干细胞外泌体在创伤性脑损伤中的应用进展

创伤性脑损伤(TBI)是交通事故中导致死亡和残疾的主要原因之一,传统神经保护治疗方法不能显著改善患者的神经功能。骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体作为一种新的治疗策略,因其抗炎、抗凋亡和神经保护等功能,显示出潜在的治疗优势。外泌体通过携带促血管生成因子和神经营养因子,促进血管生成和神经再生,调节神经炎症,从而减轻TBI引起的神经损伤。然而,外泌体治疗仍面临剂量不确定、TBI异质性影响和分离纯化技术不成熟等挑战。未来研究需进一步优化外泌体的分离技术,明确最佳治疗剂量和时机,深入探讨其靶向机制,以推动BMSCs外泌体在TBI治疗中的应用。

骨髓间充质干细胞来源外泌体对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的影响及其作用机制

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体(Exo)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的大鼠心肌纤维化的影响,并初步阐明其作用机制。方法:从BMSCs中分离提取Exo,采用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪和Western blotting法对Exo进行分析鉴定。将40只SD大鼠分为对照组、模型组、BMSCs-Exo组和BMSCs-Exo+铁死亡激活剂(Erastin)组,每组10只。除对照组外,其余3组大鼠均皮下注射ISO建立心肌纤维化模型,BMSCs-Exo组和BMSCs-Exo+Erastin组大鼠尾静脉注射BMSCs-Exo,且BMSCs-Exo+Erastin组大鼠再腹腔注射Erastin。4周后,超声心动图检测各组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)和左心室收缩末期内径(LVESD), HE染色观察各组大鼠心肌组织病理形态表现,Masson染色观察各组大鼠心肌组织纤维化程度,免疫组织化学染色检测各组大鼠心肌组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)阳性表达率,比色法测定各组大鼠心肌组织中铁离子(Fe^(2+))水平,Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 (ACSL4)、铁蛋白重链1 (FTH1)、谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)和溶质载体家族7成员11 (SLC7A11)蛋白表达水平。结果:从BMSCs中分离的颗粒物具有典型的脂质双分子层,粒径大多分布在波长100 nm处,CD63、CD9、肿瘤易感基因101 (TSG101)和热休克蛋白70 (HSP70)蛋白均高表达,由此判定为Exo。与对照组比较,模型组大鼠LVEF和LVFS明显降低(P<0.05),LVEDD和LVESD明显升高(P<0.05),心肌细胞排列紊乱,部分细胞核皱缩和坏死,胶原容积分数(CVF)明显升高(P<0.05),α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ阳性表达率明显升高(P<0.05),心肌组织中Fe^(2+)水平明显升高(P<0.05),ACSL4蛋白表达水平明显升高(P<0.05),FTH1、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,BMSCs-Exo组大鼠LVEF和LVFS明显升高(P<0.05),LVEDD和LVESD明显降低(P<0.05),心肌组织损伤明显减轻,CVF明显降低(P<0.05),α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ阳性表达率明显降低(P<0.05),心肌组织中Fe^(2+)水平明显降低(P<0.05),ACSL4蛋白表达水平明显降低(P<0.05),FTH1、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与BMSCs-Exo组比较,BMSCs-Exo+Erastin组大鼠LVEF和LVFS明显降低(P<0.05)、LVEDD和LVESD明显升高(P<0.05),心肌细胞出现水肿和坏死,CVF明显升高(P<0.05),α-SMA、COL-Ⅰ及COL-Ⅲ阳性表达率明显升高(P<0.05),心肌组织中Fe^(2+)水平明显升高(P<0.05),ACSL4蛋白表达水平明显升高(P<0.05),FTH1、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:BMSCs来源Exo能够改善ISO诱导的大鼠心肌纤维化,该机制可能与抑制铁死亡有关。

人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

背景:间充质干细胞可通过分泌含细胞因子、生长因子和外泌体的细胞外囊泡调节肿瘤微环境,对肿瘤细胞生物学行为进行精准调控。目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过高速离心并过滤获得人脐带间充质干细胞条件培养基;收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过超高速梯度离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体。使用PKH26标记人脐带间充质干细胞外泌体,与肝癌细胞MHCC97-H共培养,荧光显微镜观察MHCC97-H细胞摄取外泌体情况。通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式凋亡实验评估人脐带间充质干细胞条件培养基、人脐带间充质干细胞外泌体对肝癌细胞生物学功能的影响。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞外泌体可被MHCC97-H细胞摄取且主要分布于细胞质中;(2)人脐带间充质干细胞条件培养基处理后,MHCC97-H细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.05,P<0.01),凋亡能力显著下降(P<0.001);而人脐带间充质干细胞外泌体处理后,MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P<0.001),迁移、侵袭及凋亡能力显著增强(P<0.001);(3)结果表明,人脐带间充质干细胞条件培养基具有促进MHCC97-H细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡的能力;而人脐带间充质干细胞外泌体则具有促进MHCC97-H细胞迁移、侵袭及凋亡和抑制增殖的能力。

TGM2过表达的骨髓间充质干细胞外泌体抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡

目的探究转谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)过表达的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体在乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡中的作用及机制。方法选用20只6周龄雄性SD大鼠[体质量(350±50)g]用于提取髓核细胞。利用乳酸构建原代髓核细胞氧化应激性凋亡模型;利用慢病毒载体在BMSCs中过表达TGM2蛋白,提取外泌体并进行鉴定;后为验证TGM2过表达的外泌体抗髓核细胞氧化应激性凋亡潜在机制,利用流式细胞术对髓核细胞活性氧水平进行检测,Western blot、免疫荧光对髓核细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、磷酸化PI3K、磷酸化Akt、核内Nrf2、胞质Nrf2、HO-1蛋白表达水平及Nrf2核内荧光表达情况进行检测,分为4组(n=3):对照组、乳酸处理组、乳酸+对照外泌体组、乳酸+TGM2过表达外泌体组,评估髓核细胞的氧化应激性凋亡程度及PI3K/Akt/Nrf2通路变化情况。结果10 mmol/L乳酸能够更好的诱导髓核细胞氧化应激性凋亡(P<0.05);对照BMSCs组和TGM2过表达BMSCs组均可产生外泌体且能够稳定过表达TGM2(P<0.05,P<0.01);且相较于乳酸处理组,乳酸+TGM2过表达外泌体组和乳酸+对照外泌体组的髓核细胞均表现为凋亡率降低(P<0.05),活性氧水平下降(P<0.05),乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡、活性氧蓄积效果更好(P<0.05),髓核细胞内Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达均下降(P<0.05),Bcl-2蛋白水平均增高(P<0.05),PI3K、Akt磷酸化程度均增强(P<0.05),Nrf2核内表达均增加,抗氧化应激因子HO-1表达均增多,乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡及PI3K/Akt/Nrf2通路激活程度更强(P<0.05)。结论TGM2过表达的BMSCs外泌体可抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡,其机制可能与PI3K/Akt/Nrf2通路激活有关。

调整细胞培养条件提高间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的潜能

背景:间充质干细胞外泌体有望发展成为治疗骨关节炎的无细胞疗法,而通过调整细胞培养条件,可以进一步提高其治疗活性和临床转化潜能。目的:综述分析细胞培养条件对外泌体活性的影响,分析其临床转化潜力。方法:查阅国内外有关骨关节炎/软骨损伤修复与间充质干细胞来源外泌体的文献。检索词分别为“外泌体,间充质干细胞,骨关节炎,软骨修复”和“exosomes,extracellular vesicles,mesenchymal stem cells,osteoarthritis,cartilage repair”,检索数据库分别为PubMed和中国知网数据库,检索时限为2010-2023年,最后纳入100篇文献进行总结和分析。结果与结论:(1)在间充质干细胞的培养过程中,提供有利于软骨细胞生长的物理环境,或添加软骨保护小分子、成软骨诱导因子和炎症因子等刺激细胞,可以进一步提高间充质干细胞外泌体在维持软骨细胞表型、促进软骨再生和免疫抑制等方面的调控活性;因此,其他具有相似特征的物理或化学因素,也有可能提升间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的疗效。(2)低氧诱导、脉冲电磁场刺激、生物反应器及软骨保护分子(如人甲状旁腺素1-34)刺激等细胞培养方案具有安全、可规模化生产等优点,可用于制备临床用途的、疗效好的间充质干细胞外泌体。(3)间充质干细胞外泌体有望实现骨关节炎的修正治疗,通过调整细胞培养方案提升治疗活性,可进一步提高其临床转化的可行性。

姜黄素介导的骨髓间充质干细胞外泌体对ACC-M细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨姜黄素介导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)外泌体对ACC-M细胞增殖和转移的影响及其作用机制。方法:将7.5μmmol/L的姜黄素与人BMSCs共培养72 h后,分离外泌体并进行鉴定,将外泌体与ACC-M细胞进行共培养,并将ACC-M细胞分为control组(正常培养)、BMSC-Exo组(未经姜黄素处理的BMSCs外泌体与ACC-M细胞共培养)、Cur-BMSC-Exo组(经姜黄素处理的BMSCs外泌体与ACC-M细胞共培养)及Cur组(经7.5μmmol/L的姜黄素处理细胞);培养48 h后使用蛋白质印迹法(Western blotting)实验检测外泌体肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG-101)、CD63、CD9和重组人钙连蛋白(calnexin,CANX)及ACC-M细胞上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的蛋白表达情况;使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK8)实验检测ACC-M细胞存活率;使用transwell实验检测ACC-M细胞迁移和侵袭情况;使用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测ACC-M细胞TGF-β1和ERK mRNA相对表达量。结果:与control组和BMSC-Exo组比较,Cur-BMSC-Exo组和Cur组的细胞活力、细胞迁移和侵袭数量及N-cadherin、vimentin、TGF-β1和ERK表达水平均显著降低(P<0.05),而E-cadherin蛋白水平显著增加(P<0.05);与Cur-BMSC-Exo组比较,Cur组细胞活力、细胞迁移和侵袭数量及N-cadherin、vimentin、TGF-β1和ERK表达水平均显著增加(P<0.05),而E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论:BMSCs分泌的外泌体可作为姜黄素的载体,抑制ACC-M细胞的增殖和转移并调控TGF-β1/ERK信号通路。

骨髓间充质干细胞来源外泌体的微小RNA-22-3p参与抑制环磷酰胺诱导卵巢颗粒细胞损伤的机制研究

目的分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对卵巢早衰的影响。方法选取接受体外受精或者第二代试管婴儿治疗的卵巢早衰患者以及接受同样治疗的因男性因素不孕的正常志愿者提供卵泡液;通过差速离心法分离骨髓间充质干细胞来源外泌体;分离外泌体的形态学、粒子大小以及标志蛋白通过透射电子显微镜、NanoSight LM10分析仪以及蛋白免疫印迹方法进行分析。将颗粒细胞经环磷酰胺(CTX)、外泌体、miR-22-3p模拟物以及相应对照处理,分为CTX组、Control组、外泌体孵育组、PBS处理组、CTX+miR-22-3p组、CTX+miR-NC组、CTX+Exosomes组以及CTX+PBS组;采用蛋白免疫印迹法和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因表达水平;利用二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂以及流式分析仪检测细胞活力和凋亡。结果提取的外泌体具有典型的杯状囊泡,外泌体标志蛋白簇状分化抗原63(CD63)和簇状分化抗原9(CD9)表达在所提取的细胞上清外泌体中,外泌体粒子大小为80~150 nm;miR-22-3p在卵巢早衰患者和CTX诱导的卵巢颗粒细胞中显著低表达(P<0.05),在骨髓间充质干细胞来源外泌体孵育卵巢颗粒细胞中显著高表达(P<0.05);颗粒细胞活力在CTX组低于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-22-3p抑制CTX诱导的卵巢颗粒细胞损伤。

PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化修复牙槽骨缺损

目的:探究PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用。方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒。制备BMSCs来源外泌体(bone mesenchymal stem cells-exosomes,BMSCs-exo),蛋白质印迹法鉴定表达标志物。制备PF-127水凝胶和BMSCs-Exo复合物,PKH67标记法检测BMSCs的摄取;茜素红染色检测BMSCs的成骨能力;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测细胞中miR-132表达和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA表达。建立牙槽骨缺损大鼠模型,将大鼠随机分为PF-127水凝胶组、PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组。微型计算机断层扫描(Micro-computed tomography,micro-CT)评估牙槽骨缺损情况;蛋白质印迹法检测牙槽骨组织中ALP、OCN、Runx2蛋白表达。结果:anti-miR-132组BMSCs中miR-132表达明显低于anti-miR-NC组(P<0.05),提示anti-miR-132成功转染至BMSCs中。BMSCs-exo-anti-miR-NC组和BMSCs-exo-anti-miR-132组中外泌体标志物CD9和CD63显著表达。和BMSCs-exo-anti-miR-NC组相比,BMSCs-exo-anti-miR-132组中miR-132表达明显降低(P<0.05)。和PF127水凝胶组相比,BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组中miR-132表达均明显降低,茜素红染色相对活性、细胞中Runx2、ALP和OCN mRNA表达均明显增加,且PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组变化最显著(P<0.05)。和Control组相比,PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组BV/TV比值、BMD、Tb.N和Tb.Th及细胞中Runx2、ALP、OCN蛋白表达均明显升高,Tb.Sp明显降低(P<0.05),且PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组变化最显著。结论:PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞来源外泌体来源干扰miR-132表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进牙槽骨缺损大鼠的修复。

骨髓间充质干细胞外泌体调控NLRP3炎性小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损的机制研究

目的 探究骨髓间充质干细胞外泌体通过调控NLRP3炎性小体信号通路影响糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合相关分子机制。方法 选取50只SD大鼠纳入研究,随机选取10只大鼠作为对照组,其余大鼠构建糖尿病+双侧上颌牙槽骨缺损模型,设置模型组、骨髓间充质干细胞外泌体组(BMMSC-Exos组)、MCC950组(NLRP3抑制剂)、BMMSC-Exos+MCC950组,其中BMMSC-Exos组、MCC950组、BMMSC-Exos+MCC950组SD大鼠分别尾静脉注射BMMSC-Exos及MCC950试剂,模型组注射等量盐水。模型构建28d后取大鼠上颌骨组织。TEM检测BMMSC-Exos形态,Westernblot检测BMMSC-Exos标志性蛋白CD9、CD63、CD81表达。检测各组大鼠空腹血糖水平、HE染色分析各组大鼠牙槽骨炎性浸润及Lance-Sandhu评分;Western blot检测各组大鼠牙槽骨组织内NLRP3炎性小体信号通路关键蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β)、骨代谢关键蛋白(OPG、ALP、Collal)表达。结果 BMMSC-Exos直径大小在100 nm左右,呈双凹圆盘状态,膜结构完整;与纯BMMSCs相比,BMMSC-Exos标志物蛋白CD9、CD63、CD81的含量表达明显提升(P <0.05)。糖尿病大鼠模型建立成功,BMMSC-Exos干预、NLRP3抑制剂(MCC950)下调大鼠血糖水平(P <0.05);两者联合可以进一步下调大鼠血糖水平(P <0.05);与对照组相比,糖尿病牙槽骨缺损模型建立可以下调骨再生Lane-Sandhu评分、OPG、ALP、Collal的表达(P <0.05),上调NLRP3、caspase-1、IL-1β表达(P <0.05);BMMSC-Exos干预可以再次上调Lane-Sandhu评分及OPG、ALP、Collal蛋白表达(P<0.05),下调NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达(P <0.05)。与模型组相比,BMMSC-Exos及MCC950干预后大鼠骨再生Lane-Sandhu评分、骨代谢关键蛋白(OPG、ALP、Collal)的表达提升(P<0.05);两者联合可进一步上调大鼠骨再生Lane-Sandhu评分及骨代谢关键蛋白表达(P <0.05)。结论 骨髓间充质干细胞外泌体通过抑制NLRP3炎症小体活性来改善糖尿病牙槽骨缺损大鼠骨代谢,降低炎症反应,促进骨缺损的愈合。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用研究

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用。方法:选择2013年10月—2014年3月河南省洛阳正骨医院实验室试验的78例大鼠为研究对象,应用随机抛球法将大鼠分为手术组(n=26)、对照组(n=26)、外泌体组(n=26)。通过脊髓法建立大鼠脊髓损伤模型后,对照组不作处理,手术组在对照组的基础上实施切开减压术,而外泌体组在对照组的基础上实施全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,应用ExoQuickPrecipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63,在造模1 h后尾静脉给予外泌体移植500μL。分别采用BBB评分、斜板实验在术后1、3、7、14、21、28 d评价大鼠的运动功能恢复情况,并于术后28 d处死试验大鼠,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:术后各时间点手术组大鼠BBB评分高于对照组和外泌体组,术后7、14、21、28 d外泌体组大鼠BBB评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。手术组术后各时间点斜板评分高于对照组及外泌体组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后28 d,手术组的脊髓组织HE染色体等均正常,神经元数目减少。结论:BMSCs外泌体静脉移植对脊髓损伤有明显的改善作用,可以提高患者的运动能力,减轻脊髓损伤,加速脊髓损伤的恢复。

人骨髓间充质干细胞外泌体来源的miR-335-5p促进人牙周膜干细胞的成骨分化:基于下调DKK1表达

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)外泌体来源的miR-335-5p调控DKK1对人牙周炎中牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的影响及其作用机制。方法提取hBMMSCs外泌体,通过透射电镜、Western blot以及PKH67标记鉴定外泌体,通过TNF-α诱导PDLSCs构建牙周炎细胞模型。提取的外泌体与TNF-α诱导的PDLSCs共同培养。qRT-PCR检测miR-335-5p,促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和成骨标志基因RunX2、OCN、BMP-2 mRNA表达。茜素红和ALP染色检测钙结节,Western blot检测DKK1蛋白表达,双荧光素酶报告实验验证miR-335-5p与DKK1的靶向关系。结果提取的hBMMSCs外泌体中CD9和CD81显著表达(P<0.05)。hBMMSC外泌体降低TNF-α诱导的hPDLSCs中促炎细胞因子IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.05)、IL-8(P<0.05)的mRNA表达并促进成骨标志基因RunX2(P<0.01)、OCN(P<0.05)、BMP-2(P<0.001)mRNA和钙结节生成。miR-335-5p在hBMMSCs外泌体中高表达,过表达miR-335-5p靶向下调DKK1(P<0.001),抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8的表达(P<0.001),促进成骨标志物BMP-2、OCN、RunX2的mRNA表达以及钙结节生成(P<0.001)。结论hBMMSC外泌体来源的miR-335-5p靶向下调DKK1,促进hPDLSCs成骨分化,抑制牙周炎的发展进程。