重组PCR——一种快速体外基因重组技术

重组PCR是一种用于体外进行基因重组的简单、高效、快速技术 ,在基因重组过程中 ,不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约 ,连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶 ,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。

应用二次PCR技术提高体外基因扩增的效率

自1985年Mullis等创立PCR技术以来,作为一种基因研究的新方法,在传染病、遗传病、肿瘤及基因工程的诊断和研究等许多领域内得到广泛应用,是分子生物学研究技术的重大突破.PCR方法灵敏、特异、简便、快速,但实验受诸多因素的影响,可以造成非特异性扩增产物或扩增产物的产量不足等,使实验达不到预期结果.为此我们建立了PCR二次扩增方法,弥补了第一次扩增有时出现的缺陷,提高了扩增效率.

定量分析的体外基因扩增法

定量分析的体外基因扩增法解放军农牧大学刘纯杰综述军事医学科学院生物工程研究所张兆山审校ＰＣＲ技术自１９８５年建立以来，在短短的几年里得到了迅速的发展和广泛的应用，被誉为分子生物发展史上的一个重要里程碑。笔者曾就ＰＣＲ技术的新发展及ＰＣＲ在基因重组与突...

pcDNA3.1(-)/tPA-交联明胶微球复合物体外基因转染的实验研究

目的:检测交联明胶微球结合和缓释pcDNA3.1(-)/tPA的能力及其转染体外培养人脐静脉内皮细胞的瞬时转染效率。方法:采用紫外分光光度法检测交联明胶微球结合pcDNA3.1(-)/tPA的最大包封率和体外缓释规律;采用免疫荧光染色法检测pcDNA3.1(-)/tPA-交联明胶微球复合物缓释的pcDNA3.1(-)/tPA转染内皮细胞的瞬时转染效率。结果:交联明胶微球能有效结合pcDNA3.1(-)/tPA,最大包封率为62.75±3.31%;且在体外能持续缓释质粒DNA超过4周。pcDNA3.1(-)/tPA-交联明胶微球复合物缓释的pcDNA3.1(-)/tPA能被转移进入人脐静脉内皮细胞中并有效表达,瞬时转染效率为12.74±2.53%。结论:交联明胶微球能良好结合和缓释pcDNA3.1(-)/tPA,并能成功进行体外基因转染。

超声/微气泡SonoVue介导体内和体外基因转导的研究

目的初步探讨超声联合微气泡超声造影剂SonoVue介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导的可行性,并研究不同超声波参数和基因用量与转基因效率之间的关系。方法利用不同强度和不同剂量超声波和声学造影剂SonoVue,介导人肝癌细胞株HepG2和BALB/c小鼠右侧胫前肌内增强型绿色荧光蛋白报告质粒的转导,分别直接或组织冰冻切片后在荧光显微镜下观察,并计算转导效率。结果超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养的HepG2细胞和小鼠胫前肌内pEGFPC1基因转导,HepG2细胞以1MHz1.5W/cm2超声波基因转导效果最好;小鼠胫前肌以1MHz3W/cm2的超声波转基因效果最好。结论超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导,1MHz超声波是转基因的理想频率。

腺病毒介导人血管内皮生长因子体外基因转染在兔喉气管重建模型中的应用

喉气管缺损可引起喉狭窄,临床上常采用自体肋软骨和耳廓软骨等移植物进行喉气管重建。但自体软骨移植由于局部新生血管少,软骨营养障碍常导致移植物坏死或吸收,致使气管腔术后再狭窄。血管内皮细胞生长因子(VEGF)可诱导间质细胞分裂。

磁性氧化铁纳米颗粒用于体外基因的转染及其外加磁场对于转染效率的影响

目的 评价氧化铁纳米颗粒 (IONP)作为体外基因载体的可行性及其外加磁场对于其转染效率的影响。方法 以碱沉淀法制成IONP ,在其表面修饰多聚赖氨酸制成多聚赖氨酸 氧化铁纳米颗粒 (IONP PLL)。应用荧光素酶报告基因系统 ,检测IONP PLL将外源基因转染至不同的细胞系的转染特性 ,同时 ,应用钕 铁 硼稀土强磁场结合荧光素酶报告基因 ,评价外加磁场对于IONP PLL作为基因载体效率的影响。结果 IONP可将外源基因转染至多个细胞系并高效表达。不同细胞系的转染效率和时间各不相同。外加磁场可使转染效率提高 5～ 10倍。结论 磁性IONP是一种可用于体外转染的新型非病毒基因载体 ,外加磁场可提高其转染效率。

新型靶向纳米材料介导基因治疗胶质瘤的体外研究

目的:合成可降解性叶酸(FA)-PEG-PEI和PEG-PEI并研究其负载质粒DNA的能力,比较所形成纳米材料/DNA复合物在体外对细胞的毒性大小及其转染效率,为进一步体内基因治疗做好准备。方法:化学方法合成可降解性FA-PEG-PEI和PEG-PEI,检测所形成纳米材料/DNA复合物的粒径、zeta-电位和凝胶阻滞能力,以及对C6(叶酸受体中度表达)、293T(叶酸高度表达)和HepG2(叶酸不表达)3种细胞的细胞毒性,并对3种细胞进行转染,分别用流式细胞仪、荧光素酶基因表达水平和倒置荧光显微镜检测转染效果。结果:FA-PEG-PEI与PEG-PEI复合pDNA后进行电位、粒度分析表明其带正电,粒径在200～300nm,FA-PEG-PEI和DNA的完全结合在N/P比为5,PEI和PEG-PEI与DNA的完全结合则出现在N/P比为10。MTT法证实了复合物在C6、293T、HepG23种细胞中的细胞毒性表明其细胞毒性比常用的PEI25ku低;在3种细胞中,转染效率从整体来看,N/P比=15时,FA-PEG-PEI萤光素酶基因表达水平最高;类似的,通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜更直观的检测了转染效果,表明FA-PEG-PEI对C6、293T细胞都有靶向效果且在N/P比为15时靶向效果最好,而在HepG2细胞中没有靶向效果。结论:此研究结果为叶酸靶向基因治疗神经胶质瘤寻找行之有效的基因载体提供了理论和实践基础,可进一步于动物体内进行联合基因治疗神经胶质瘤。

基于L5178Y细胞体外Pig-a基因突变试验方法的建立与初步探索

利用小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk+/--3.7.2C和阴性化合物Glc、NaCl及阳性化合物EMS、ENU、4-NQO、B(a)P建立并验证基于哺乳动物细胞的体外Pig-a基因突变检测方法。计算细胞相对倍增速率评价细胞毒性,抗体标记突变型细胞确定流式检测模板,L5178Y细胞经EMS处理后第4、8、12、16、20天检测Pig-a基因突变频率,确定最大突变频率发生时间点,免疫荧光技术检测CD90蛋白在细胞中的定位情况,采用PCR方法进行突变位点分析。结果表明(:1)Glc、NaCl、EMS、ENU、B(a)P、4-NQO所设浓度组RPD均大于50%。(2)Pig-a基因突变频率在给药后第8天出现峰值。Glc和NaCl致Pig-a基因突变频率均小于200×10-6,各浓度组与溶剂对照组间不存在显著性差异(P>0.05),EMS、ENU、B(a)P、4-NQO均可引起Pig-a基因突变频率增加,且与溶剂对照组相比存在显著性差异。(3)免疫荧光成像显示突变型细胞表面无CD90蛋白,野生型细胞正常表达CD45,CD90蛋白。(4)基因突变位点检测显示存在G→C、A→C、C→T三种突变类型。基于小鼠淋巴瘤L5178Y细胞分别在有无S9代谢活化条件下成功建立体外Pig-a基因突变的遗传毒性检测方法,旨为化合物体外遗传毒性评价或药物研发早期遗传毒性筛选提供新方法。

中国人群中RHAG变异对mRNA剪接影响的体外研究

目的通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响。方法通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择10种中国人群中分布频率相对较高的位于RHAG基因剪接位点附近的突变或编码区域的同义突变,构建相应的RHAG外显子野生型及突变型pSplicePOLR2G微基因表达质粒。转染HEK-293T细胞,48 h后收集细胞提取总RNA,反转录后进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测,根据实验结果判断RHAG基因突变是否会影响相应外显子的正常剪接。结果2种RHAG基因剪接位点附近突变(c.158-5delT,c.807+3A>C)轻微减弱了原剪接位点的剪接效率,其余8种突变(c.312G>A,c.341+3G>A,c.609C>T,c.681G>A,c.861G>A,c.957T>A,c.984T>C和c.1139-7G>A)均不影响RHAG基因mRNA的剪接。结论RHAG基因在剪接方面比较保守,剪接位点附近突变及编码区同义突变较少会引起RHAG基因异常剪接。

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

小麦高分子量谷蛋白亚基基因片段的体外扩增

生物体尤其是高等动植物,绝大多数基因的拷贝数是很低的,如果没有基因扩增的手段,几乎无法研究基因的结构及其与表达的关系。当今分子生物学发展中最基本的技术之一基因克隆,实际上就是基因体内扩增(in vivo amplification)的技术。近年来发展了一种基因体外扩增(in vitro amplification)的新技术。

丙型肝炎病毒NS5B的体外表达、纯化和RNA多聚酶活性鉴定

目的 研究丙型肝炎病毒NS5B蛋白的表达及其生物学功能。方法 构建长度为1676bp(7261-9036bp,编码558aa)的HCV NS5B编码区cDNA,定向克隆到表达质粒pET16b中,并在大肠杆菌BL21中表达。应用合成的多聚A或寡聚U为模板进行~3H-UTP掺入实验分析纯化蛋白的活性。结果 表达的NS5B蛋白分子量为65KD,以包涵体形式存在细胞内,改变部分表达条件未能减少包涵体的形成及可溶性蛋白的增加,该包涵体蛋白在6M尿素浓度、pH:10及500mM NaCl的溶液中完全溶解。~3H-UTP掺入实验表明纯化的蛋白具有RNA多聚酶活性并依赖多聚A的存在。结论 对NS5B蛋白生物学活性的研究,有助于了解HCV的复制及抗病毒药物的开发。

靶向纳米材料作为大鼠单个核细胞基因载体的研究

目的:探讨纳米材料聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEG-PEI)作为基因载体的可行性研究,研究其负载质粒DNA(p DNA)的能力,分析所形成纳米材料/p DNA复合物的特性,以及体外对细胞的毒性大小及其转染效率。方法:以PEI为对照,合成PEG-PEI,采用MTT法检测所形成纳米材料/DNA复合物对大鼠单个核细胞(PBMC)的细胞毒性,再采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效果。结果:N/P<10时,PEG-PEI和PEI的存活率分别为82.7%及81.3%(P﹥0.05);N/P=10时,PEG-PEI是81%,PEI为59%(P<0.05);N/P﹥10时,PEG-PEI的细胞存活率比PEI低(P<0.05)。N/P=10时,用倒置荧光显微镜观测PEG-PEI较PEI表达的绿色荧光多,荧光强度大(P<0.05);同时利用流式细胞仪检测PEG-PEI和PEI的转染效率,分别为28.9%和12.5%(P<0.05)。结论:纳米材料PEG-PEI具有强的负载能力,转染效率高,细胞毒性低的优点,为作为多发性硬化基因载体的可行性奠定了实践基础。

尿外泌体中致纤维化基因表达在早期糖尿病肾病诊断中的作用研究

目的 探讨尿外泌体中致纤维化基因表达在诊断早期糖尿病肾病的应用价值。方法 选取2019年5月—2020年6月于广东医科大学附属厚街人民医院住院的新诊断早期2型糖尿病肾病患者16例及2型糖尿病肾病患者16例,将32例患者分别纳入研究组A组(早期2型糖尿病肾病组)和B组(2型糖尿病肾病组)。同时选取同期到医院进行体检的健康体检者16名,纳入对照组。对高糖刺激肾小管上皮外泌体miRNA进行系统分析(芯片检测)。收集了两组DN患者肾穿刺标本,进行组化染色,对比两组患者血肌酐、尿白蛋白、尿钠等的水平以及对比两组患者尿外泌体中转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA的表达等相关情况。结果 研究组血肌酐、尿白蛋白、尿钠的水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组A组的血肌酐、尿白蛋白、尿钠的水平低于研究组B组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究组A组和B组患者尿液中的TGF-β1和CTGF的mRNA表达水平均明显高于对照组(2.2±0.8)、(4.1±1.2)vs(1.0±0.2)、(1.8±1.1)、(3.8±1.8)vs(1.1±0.3),差异有统计学意义(P<0.05)。研究B组患者尿液中的TGF-β1和CTGF的mRNA表达水平明显高于研究A组,分别为(4.1±1.2)vs(2.2±0.8)和(3.8±1.8)vs(1.8±1.1),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 糖尿病肾病患者尿外泌体中致纤维化基因TGF-β1和CTGF可能是临床诊断早期糖尿病肾病及其进展的重要辅助生物学标志物。

教育·体外结构的遗传──教育发展动因及原理新探

教育·体外结构的遗传──教育发展动因及原理新探马慧敏人类作为生命系统中的一员，是由ＨｏｍｏＳａｐｉｅｎｓ与体外结构的组合体．整个组合体的新陈代谢表现出双重性的特征，首先表现的是与其他生物物种基本相同的生物学意义的新陈代谢过程，即ＨｏｍｏＳａｐｉｅｎｓ...

VEGF基因转染内皮前体细胞能促进血管新生

据近期研究报道,内皮前体细胞(EPC)已被用于治疗领域。研究人员在实验中将EPCs经过体外扩增后输注给下肢缺血或心肌缺血的动物模型体内,研究结果发现可成功地促进新血管的生成。但EPC功能有可能受到诸如衰老、糖尿病、高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等因素的影响。而基因重组技术的应用则可能成为克服这些潜在问题的手段。

用PCR突变技术克隆HIV env125肽基因

作者在计算机辅助设计下,利用DNA合成仪合成HIV env 125-1,HIV env 125-2两个寡核苷酸引物及HIV env 101-1寡核苷酸探针,以PCP技术扩增env 125肽基因。扩增产物经电泳和Southern杂交鉴定后克隆入pUC19中,筛选、鉴定后进行序列分析。结果表明,上述方法获得的env 125肽基因5’端插入了EcoRI酶切位点和起始码ATG,3’端插入了终止码TAG和HindⅢ酶切位点,且序列及读框正确。

宫颈癌中C-Ha-ras癌基因点突变的研究

宫颈癌是妇女生殖系统最常见的恶性肿瘤,严重威胁着我国妇女的身体健康和生命安全,对宫颈癌癌基因的研究有助于宫颈癌的早期诊断、防治以及肿瘤的分型。我们在国内首次将体外基因扩增技术(即PCR技术)应用于宫颈癌癌基因的研究,先人工合成两个特异性的寡核苷酸引物,在耐热DNA多聚酶的催化下,将宫颈癌DNA中C-Ha-ras癌基因第一个外显子的核苷酸序列放大百万倍左右,再以同位素标记的特异寡核苷酸探针杂交。