中国人群中RHAG变异对mRNA剪接影响的体外研究

目的通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响。方法通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择10种中国人群中分布频率相对较高的位于RHAG基因剪接位点附近的突变或编码区域的同义突变,构建相应的RHAG外显子野生型及突变型pSplicePOLR2G微基因表达质粒。转染HEK-293T细胞,48 h后收集细胞提取总RNA,反转录后进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测,根据实验结果判断RHAG基因突变是否会影响相应外显子的正常剪接。结果2种RHAG基因剪接位点附近突变(c.158-5delT,c.807+3A>C)轻微减弱了原剪接位点的剪接效率,其余8种突变(c.312G>A,c.341+3G>A,c.609C>T,c.681G>A,c.861G>A,c.957T>A,c.984T>C和c.1139-7G>A)均不影响RHAG基因mRNA的剪接。结论RHAG基因在剪接方面比较保守,剪接位点附近突变及编码区同义突变较少会引起RHAG基因异常剪接。