孕酮对人T淋巴细胞体外活化CD69表达的作用

目的 :探讨孕酮 (Progesterone ,Prog)及地塞米松 (Dexamethasone,Dex )对人外周血T淋巴细胞体外活化CD6 9表达的作用。方法 :以女性健康志愿者 (10名 )为研究对象 ,以蛋白激酶C的刺激剂佛波醇酯 (Phorbolester,PDB)为T淋巴细胞的活化剂 ,采用双荧光染色流式细胞技术 ,检测CD3+的T淋巴细胞表达早期活化表面分子CD6 9的百分率 ,以观察Prog、Dex及Prog加上Dex对外周血T淋巴细胞体外活化的作用。结果 :在体外培养条件下 ,无论单独使用Prog还是Dex均增强低剂量PDB刺激CD6 9的表达。然而 ,与单独使用Prog或Dex的作用相比 ,Prog加上Dex明显减弱低剂量PDB的活化CD6 9的表达。结论 :同时使用Prog与Dex可明显抑制T淋巴细胞的体外活化 。

双黄连粉针剂对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响

目的:探讨双黄连粉针剂(以下简称SHL)对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖的影响。方法:MTT法检测SHL对小鼠淋巴细胞的毒副作用;双色荧光抗体染色技术结合流式细胞术分析SHL对小鼠T淋巴细胞在多克隆刺激剂(ConA)刺激下体外活化抗原CD69表达的影响;MTT法以及羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)标记技术结合流式细胞术分析SHL对小鼠T淋巴细胞在ConA诱导下体外增殖的影响。结果:SHL对小鼠淋巴结来源的淋巴细胞毒副作用非常小;终质量浓度为60、80、100、120mg/L的SHL对ConA刺激下的T淋巴细胞体外活化抗原CD69表达具有抑制作用(P<0.01);MTT法和CFDA-SE染色法都显示,终质量浓度为60、80、100、120mg/L的SHL对ConA诱导的T淋巴细胞增殖作用具有明显的抑制作用(P<0.01)。结论:SHL对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖具有明显的抑制作用。

雷公藤甲素对小鼠淋巴细胞体外活化的抑制作用

目的研究雷公藤甲素(TRD)对小鼠T淋巴细胞活化标志CD69、CD25及细胞因子IL2及IFNγmRNA表达的影响,为阐明其免疫抑制作用提供分子药理学依据。方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的雷公藤甲素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆体双染技术,流式细胞仪检测TRD对小鼠T细胞CD69、CD25表达的影响;采用半定量RTPCR技术从mRNA水平检测TRD对细胞因子IL2、IFNγmRNA的表达的影响。结果TRD能抑制T细胞早期活化标志CD69和CD25,同时TRD也能抑制IL2及IFNγmRNA的表达。结论TRD对T细胞早期活化分子及细胞因子表达的抑制作用可能是其发挥免疫抑制作用的机制之一。

CD58、雌酮及孕酮对附植早期山羊EML的体外活化

研究了 CD5 8、雌酮及孕酮对附植早期山羊子宫内膜淋巴细胞 (EML)体外活化作用的影响。结果表明 ,山羊红细胞源性 CD5 8(总玫瑰花结形成抑制率为 5 8.89% )能以剂量依赖方式促进妊娠 1 6、1 7及 2 0 d山羊 EML的体外活化。极低浓度的雌酮 (4 0 pg/m L)对妊娠 1 6d山羊 EML表现极显著的活化作用 ,对妊娠 1 7d山羊 EML只表现微弱的激活作用 ,对妊娠 2 0 d山羊 EML的激活作用不明显。生理水平的孕酮 (2 .5～ 1 0ng/m L)单独作用时 ,能以剂量依赖方式显著促进妊娠 2 0 d山羊

体外活化Th17细胞最适条件的研究

目的:探索体外活化Th17细胞的适宜条件。方法:检测细胞表面CD69及细胞内IL-17的表达判断Th17细胞的活化效果,比较不同浓度(25、7、150、250 ng/ml)的佛波酯(PMA),联合离子霉素和莫能霉素刺激培养外周血单个核细胞(PBMC)4～6 h Th17细胞的活化效果;另比较最佳浓度的PMA与离子霉素、莫能霉素组合和Leukocyte Activation Cocktail试剂刺激培养人PBMC 4 h Th17细胞的活化效果。结果:在25 ng/ml PMA加入离子霉素处理3 h后再加莫能霉素刺激淋巴细胞3 h后,CD4+T细胞中CD69阳性细胞含量>90%,Th17细胞比例最高且结果稳定,而Leukocyte Activation Cocktail试剂刺激后CD69阳性细胞含量为30%～80%,含IL-17的CD4+T细胞未明显增多。结论:PMA 25 ng/ml加离子霉素(1μg/ml)刺激1 h后,加莫能霉素(1.7μg/ml)刺激培养3 h,为体外活化Th17细胞的适宜条件。

人重组胱天蛋白酶原-3的表达和体外活化

目的 :建立一个在短时间内获取大量活化胱天蛋白酶 3的方法。方法 :将胱天蛋白酶 3酶原的基因从真核表达载体中克隆到原核表达载体 pMTY4 His中 ,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达MS2 胱天蛋白酶原 3融合蛋白 ;将包涵体变性 ,经酸化和浓缩进行体外活化 ;对所得蛋白用Westernblot和活性试验进行鉴定。结果 :构建成pMTY4 His 胱天蛋白酶 3原核表达载体 ,在大肠杆菌中获得了较高水平表达的胱天蛋白酶原 3酶原 MS2融合蛋白。体外活化后每升诱导菌可获得约 10mg蛋白 ,用抗胱天蛋白酶 3单克隆抗体证实所得蛋白为胱天蛋白酶原 3,活性试验证实得到高活性的蛋白。结论 :成功地建立了大量获取高活性的胱天蛋白酶 3的方法 ,为深入研究胱天蛋白酶

CD69分子在肿瘤抗原体外活化H22肝癌腹水瘤小鼠脾淋巴细胞的表达

目的:探讨H22肝癌腹水瘤小鼠淋巴细胞在多克隆激活剂刀豆蛋白A(ConA)、H22肝癌细胞肿瘤抗原刺激下,体外活化细胞表面分子CD69的表达,判定肿瘤进行性生长时和后期机体的免疫状态。方法:将H22肝癌细胞接种于BALB/C小鼠腹腔,建立H22肝癌腹水瘤模型。观测成瘤率、平均体重;利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测淋巴细胞早期活化标志-活化细胞表面分子CD69,在分别加入10%FBS的RPMI-1640完全培养液、ConA(终浓度为10ug/mL)、H22肿瘤抗原(2×106cells/mL)刺激物刺激下的表达情况。结果:接种H22肝癌腹水瘤的成瘤率100%,H22肝癌腹水瘤组平均体重为(32.03±3.44)g,生理盐水对照组无肿瘤生成,平均体重为(19.15±1.14)g,两组差异有显著性(t=7.12,p=0.00)。荷瘤鼠体重变化随时间推移呈对数增长,而对照组呈平缓增长,两因素方差分析,荷瘤鼠与非荷瘤对照组之间差异有显著性(F=5.71,p=0.05),不同天数的体重差异有高度显著性(F=63.15,p=0.00)。荷瘤鼠脾T细胞的CD69分子体外活化率分别为(7.59±8.68,19.42±12.57,5.38±8.24)%,对照组脾T细胞的CD69分子体外活化率分别为(15.81±9.92,44.96±13.84,15.18±9.15)%,荷瘤鼠CD69分子体外活化率无论RPMI-1640组、ConA组,还是H22肿瘤抗原组,均比对照组的RPMI-1640组、ConA组、H22肿瘤抗原组明显降低,经多因素方差分析,差异有显著性(F=9.20,p=0.01)。结论:在肝癌感染后期,荷瘤鼠T细胞的CD69分子体外活化明显降低,机体免疫功能受到抑制。

RNA干扰下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞α-微管蛋白及γ-微管蛋白表达的影响

目的:探讨RNA干扰下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外活化肝星状细胞(HSC)α-微管蛋白(α-tubulin)及γ-微管蛋白(γ-tubulin)表达的影响。方法:2017年9月至2018年3月,以腺病毒为载体将靶向PTEN的RNA干扰序列—短发夹RNA(shRNA)转染体外培养的活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,实验分为3组:对照组(Control组,以DMEM代替腺病毒液进行腺病毒转染)、Ad-GFP组(以对照空病毒Ad-GFP转染体外活化HSC)、Ad-shRNA/PTEN组(以携带靶向PTEN的shRNA的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN转染体外活化HSC),每组设6个复孔。采用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测各组HSC的PTEN蛋白及mRNA表达;免疫荧光法检测各组HSC的α-tubulin及γ-tubulin表达。结果:与对照组及Ad-GFP组比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的PTEN蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05)。HSC的α-tubulin主要表达于细胞浆,对照组和Ad-GFP组HSC的α-tubulin呈丝网状、辐射状均匀分布于细胞核周围,而Ad-shRNA/PTEN组HSC的α-tubulin向细胞两端末梢逐渐聚集并在细胞两端稍增多;与对照组HSC的α-tubulin荧光积分光密度值(IOD)(40803.00±2006.59)及Ad-GFP组HSC的α-tubulin荧光IOD(42302.50±2537.93)比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的α-tubulin荧光IOD(101495.17±5005.39)明显升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组HSC的α-tubulin荧光IOD比较差异无统计学意义(P>0.05)。HSC的γ-tubulin也主要表达于胞浆,并在胞浆中有散在点状聚集,但Ad-shRNA/PTEN组HSC的γ-tubulin点状聚集更明显;与对照组HSC的γ-tubulin荧光IOD(20410.68±1815.53)及Ad-GFP组HSC的γ-tubulin荧光IOD(20137.50±1469.49)比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的γ-tubulin荧光IOD(41310.83±1544.68)明显升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组HSC的γ-tubulin荧光IOD比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:下调体外活化肝星状细胞的PTEN表达可显著增加其α-微管蛋白及γ-微管蛋白表达,并引起上述微管蛋白在胞浆中的分布发生变化。

输注体外活化的自身淋巴细胞治疗晚期恶性肿瘤

自身淋巴细胞生物学疗法是一种可以门诊施行的治疗晚期恶性肿瘤的过继免疫疗法。其主要程序是输注体外用抗ＣＤ３单克隆抗体等活化的，用甲氰咪胍和低剂量γ射线等去除或抑制Ｔ抑制细胞活性的自身淋巴细胞。病人同时服用甲氰咪胍以去除或抑制体内Ｔ抑制细胞的活性。作者共治疗患者６５例，２１７人次，除１０例１８人次在回输时有轻微类似输液反应的寒颤伴暂时的轻度体温升高外，未见其它毒性反应。对其中３７例输注治疗３次以上的病人，进行临床疗效分析，缓解率（ＣＲ＋ＰＲ）为２４％，有效率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＭＲ）为５１％。自身淋巴细胞生物学疗法疗效与文献报道的ＬＡＫ疗法相似，但费用低廉，副作用和毒性较低。

体外活化脐血免疫活性细胞输注治疗小儿急性淋巴细胞白血病微量残留病疗效观察

目的 观察体外激活培养的脐血免疫活性细胞对急性淋巴细胞白血病患儿微量残留病 (MRD)的免疫治疗作用。方法 收集无菌ACD抗凝脐血 ,进行单个核细胞分离与植物血凝素 (PHA)培养 ,采用APAAP免疫组化方法进行PHA激活培养前后CD3、CD4、CD8测定。应用ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF α) ,利用PCR法对克隆性重排的T细胞受体 (TCR)基因进行MRD测定。结果 ①脐血经Ficoll分离、PHA激活培养后 ,其中淋巴细胞占优势 ;②激活后脐血中表达CD3、CD4、CD8抗原淋巴细胞比例增高 ;③PHA激活前脐血TNF α <10ng/L ,激活后TNF α维持在较高水平 ,超过 6 0 0ng/L ;④ 6例ALL患儿输注前MRD均阳性 ,有 3例经多次输注 ,1年后外周血、骨髓中MRD全部阴性 ,余 3例外周血MRD消失 ,骨髓中MRD减少。在输注过程中有 2例出现寒战、体温上升 ,1例出现皮疹。结论 体外活化脐血免疫活性细胞多次输注后MRD可减少、消失 ;

尖锐湿疣患者外周血Vα24^+天然杀伤T细胞数量与体外活化的研究

由于尖锐湿疣发病机制不清,目前尚无满意治疗方法.近几年研究发现,表达部分天然杀伤细胞受体和T细胞受体(TCR)Vα24片段的天然杀伤T(NKT)细胞在抗病毒及免疫调节中都发挥着重要作用[1].本研究采用流式细胞技术检测了不同病程尖锐湿疣患者外周血NKT细胞的数量及体外活化特性,以探讨NKT细胞在尖锐湿疣患者免疫应答中的作用.

自外周血记忆B细胞体外活化和分化抗原特异性浆细胞的方法研究

目的建立自人外周血淋巴细胞（PBMCs）中的记忆B细胞活化和分化特异性抗体分泌细胞（如浆细胞）的体外活化方法，为抗体药物研发提供研究基础。方法采集两名接种过乙型肝炎疫苗3年和25年健康成年志愿者（z和L）外周血，分离PBMCs，通过白细胞介素（IL）-2、IL-4和Toll样受体诱导剂（CpG、R848）体外诱导活化记忆B细胞。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中总抗体和HBsAg特异性抗体的含量；通过酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测培养细胞中总抗体分泌细胞（ASC）数量的变化和HBsAg特异性抗体细胞数量。结果活化第6天，对照组和两个活化组[CpGDNA2006联合IL-2（C组）和R848联合IL-2（R组）]细胞培养上清总免疫球蛋白（Ig）G浓度分别为37．06ng／mL、80．87ng／mL和85．97ng／mL，两个活化组（C组和R组）均明显高于对照组（t=23．318，60．639，P均〈0．05）。ELISPOT检测ASC数量，结果显示，C组和R组数量均多于对照组，并且R组明显多于C组。两种活化方法均能在体外诱导B细胞活化，但R组活化效果更佳，确立R组为最佳活化方法。用该方法活化两名乙型肝炎疫苗接种者PBMCs，ELISA检测活化组特异性抗体浓度，R组显著高于对照组（t=5．031，11．561，P均〈0．05）。不同细胞数量诱导的分组，ELISPOT检测HBsAg特异性抗体分泌细胞数量，R组均明显多于对照组。结论确立诱导剂R848和细胞因子IL-2联合能够有效地诱导外周血记忆B细胞体外活化和分化抗原特异性浆细胞，为今后抗体药物研发提供了研究基础。

重组DNA技术发展体外代谢活化测试系统的研究

重组ＤＮＡ技术发展体外代谢活化测试系统的研究薛开先（江苏省肿瘤防治研究所南京２１０００９）众多的原致癌剂、致突变剂需经代谢活化才能产生效应，细胞内参与活化的酶主要是细胞色素Ｐ４５０（ＣＹＰ４５０），但用于遗传毒理学检测的细胞系已丧失或较低水平地表达，...

配偶精子体外活化及宫腔内人工授精

配偶精子体外活化及宫腔内人工授精吴建力胡承阅（安徽省计划生育科研所２３００３１）不育症发病率约占已婚夫妇总数的８％。［１］使用经体外活化的精子经宫腔作人工授精，缩短精子在女性生殖道内的转运距离，帮助精子穿透宫颈粘液屏障，增加一次性进入女性生殖道的活化...

正常成人外周血全血培养激活T细胞表达活化抗原

目的 :研究正常成人外周血T细胞体外活化表达活化抗原CD 69、CD 2 5及HLA -DR的规律与蛋白激酶C(PKC)抑制剂对此的影响 .方法 :健康志愿者 ( 10名 )外周血以佛波醇酯 (PDB) +离子霉素 (Ion)或植物血凝素 (PHA)刺激不同时间后 ,经双荧光染色后获取有核细胞 ,以流式细胞仪测定CD 3+T细胞活化抗原CD 69、CD 2 5及LHA -DR的表达 .结果 :无论PDB +Ion还是PHA均可刺激CD 3+T细胞表达CD2 5,2 4h后的表达率分别达 57 5%和 39 8% .以PDB +Ion刺激 4h ,T细胞CD 69表达已达 90 %以上 ,而此时CD 2 5尚未表达 ,HLA -DR则在 72h后表达明显上调 .PKC抑制剂H 7能完全抑制PDB +Ion引起的CD 69及CD 2 5上调 ,但仅部分抑制HLA -DR的表达 .结论 :正常成人外周血CD 3+T细胞经多克隆活化剂刺激后CD 69表达最快、最高 ,CD 2 5次之 ,HLA -DR较慢较低 ;三者的表达均可被PKC抑制剂H 7所抑制 ,表明PKC在

TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆B细胞分化抗原特异性浆细胞的方法研究

目的为了从PBMCs获得病原体特异性浆细胞,我们建立了TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆B淋巴细胞分化浆细胞的方法。方法使用TLR7/8激动剂R848联合细胞因子组合,诱导接种乙肝疫苗(3年及以上)的健康志愿者来源的PBMCs,进行体外活化和分化浆细胞。分别利用ELISA和ELISPOT检测培养液上清中总IgG、HBsAg特异性IgG以及总抗体分泌细胞(ASCs)和HBsAg抗原特异性ASCs。结果成功建立R848体外诱导PBMCs中记忆B淋巴细胞分化浆细胞的方法。R848(使用质量浓度在1~2.5μg/ml)仅与IL-2联合使用,最早在第5天即可检测到特异性ASCs。结论通过该方法可以从患者恢复期少量(仅需5~10 ml)的外周血中获得抗原特异性抗体分泌细胞用于分析和分选,为中和抗体的制备提供方法。

环磷酰胺体外对人精子诱变性研究

目的 :探讨环磷酰胺 (CP)在体外测试系统中对人精子的诱变性。 方法 :使用不同浓度的CP与人精子和代谢活化酶作用 3h ,再与地鼠卵体外授精 ,研究精子染色体和 2细胞胚微核诱变作用。 结果 :CP有损伤精子染色体和诱发 2细胞胚微核作用。 结论 :CP在代谢活化酶作用的离体测试系统中 ,对人精子有诱变性 。

流式细胞术检测人外周血Th17细胞频率

目的该研究通过探讨不同的刺激培养条件和检测方法对Th17细胞频率的影响,建立和优化流式细胞术检测人外周血Th17细胞频率实验方案。方法采用不同浓度的佛波酯(PMA,终浓度50、100、150、200、250、300ng/mL)与离子霉素(Ionomycin)1μg/mL对健康人外周血进行刺激培养,分别于刺激后4、6、8、10和12h用流式细胞术分析Th17细胞频率,并检测PMA刺激前后细胞表面与胞膜内CD4平均荧光强度(MFI)和CD4阳性T细胞比例。结果 PMA 150ng/m+Ionomycin 1μg/mL刺激全血6h后,Th17细胞频率高,刺激的效果较好(P<0.05)。刺激后检测细胞膜内CD4MFI低于先标记膜表面CD4后刺激组(P<0.05),Th17细胞频率和CD4阳性T细胞比例均高于后者,差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用终浓度为PMA 150ng/mL+Ionomycin 1μg/mL刺激培养全血6h后,测定胞浆内CD4和IL-17水平是检测人Th17细胞频率简便有效的方法。