单抗诱发性细胞因子释放综合征和体外细胞因子释放实验的研究进展

单克隆抗体引发的细胞因子释放综合征(CRS)具有发病迅速、危害严重、难以预测和控制等特点。近年来,建立可靠的体内动物模型和体外细胞因子释放实验(CRA)预测CRS的发生成为临床前安全性评价的研究热点。该文着重从CRA的适用对象、方法设计考虑因素、方法优化等方面进行综述,为CRA预测平台的优化提供建议。

肺泡灌洗液外泌体表皮生长因子受体基因突变检测对晚期非小细胞肺癌患者的临床意义

目的通过对比分析晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者支气管肺泡灌洗液(BALF)外泌体、血液和肺癌组织3种标本表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况,评估支气管肺泡灌洗液外泌体标本是否适合应用于临床靶向治疗前的患者筛检,为晚期NSCLC患者尽早个体化治疗提供新的思路和筛检方法。方法回顾性分析2021年5月至2023年5月贵州航天医院呼吸与危重症医学科78例晚期NSCLC患者利用扩增阻滞突变系统法(ARMS)检测支气管泡灌洗液外泌体、血液、肺癌组织标本EGFR基因突变的结果并以肺癌组织标本结果为标准进行相互比较。结果支气管肺泡灌洗液外泌体、血液、肺癌组织标本分别检出EGFR突变型33、25、38例,EGFR基因野生型分别42、53、40例,检测突变率分别为42.3%(33/78)、32.1%(25/78)、48.7%(38/78)。支气管肺泡灌洗液检测无结果3例,假阴性率6.4%(5/78),血液检测假阴性率16.7%(13/78)。支气管肺泡灌洗液外泌体标本EGFR基因突变的检测符合率86.8%(33/38),血液标本检测符合率65.8%(25/38)。结论支气管肺泡灌洗液外泌体标本检测EGFR基因突变与血液、肺癌组织标本检测具有一致性(P>0.05),优于血液标本,适用于临床靶向治疗前的患者筛选,为晚期NSCLC患者尽早个体化治疗决策提供了新的思路和筛检方法。

骨健口服液联合间充质干细胞来源外泌体治疗小鼠膝骨关节炎的实验研究

目的:探讨骨健口服液联合间充质干细胞来源外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-EXO)治疗小鼠膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的效果及作用机制。方法:将25只12周龄雄性无特定病原C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、骨健组、MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组,每组5只。假手术组仅切开关节囊而不切断内侧半月板,其余4组均采用内侧半月板失稳法构建KOA模型。骨健组、骨健MSC-EXO组小鼠每日用0.2 mL的骨健口服液灌胃,假手术组、模型组、MSC-EXO组小鼠每日用等量的生理盐水灌胃,均连续8周。MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组小鼠每周膝关节腔注射1次10μL的MSC-EXO,其余各组小鼠每周膝关节腔注射1次等量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS),均连续8周。干预8周后处死小鼠,进行小鼠膝关节Micro-CT分析、膝关节软骨组织病理学观察、膝关节软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白α1链(collagenⅡα1,Col2A1)表达水平检测。结果:①小鼠膝关节Micro-CT分析结果。假手术组、骨健组、MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组小鼠的骨体积分数均低于模型组(P=0.004,P=0.007,P=0.040,P=0.001),骨健组、MSC-EXO组小鼠的骨体积分数与骨健MSC-EXO组的差异均无统计学意义(P=0.108,P=0.126)。假手术组、骨健组、MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组小鼠的骨小梁厚度均大于模型组(P=0.015,P=0.023,P=0.023,P=0.009),骨健组、MSC-EXO组小鼠的骨小梁厚度与骨健MSC-EXO组的差异均无统计学意义(P=0.347,P=0.062)。假手术组和骨健组小鼠的骨小梁数量多于模型组(P=0.016,P=0.021),MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组小鼠的骨小梁数量与模型组的差异均无统计学意义(P=0.196,P=0.206)。假手术组、骨健组、MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组小鼠的骨小梁分离度均小于模型组(P=0.016,P=0.012,P=0.007,P=0.001),骨健MSC-EXO组小鼠的骨小梁分离度小于骨健组(P=0.016),MSC-EXO组小鼠的骨小梁分离度与骨健MSC-EXO组的差异无统计学意义(P=0.224)。②小鼠膝关节软骨组织病理学观察结果。假手术组小鼠的关节软骨表面光滑,软骨细胞排列有序,提示无明显关节软骨退变。与假手术组相比,模型组小鼠的关节软骨组织磨损明显,软骨细胞数量减少且排列紊乱。与模型组相比,骨健组和MSC-EXO组小鼠仅有部分关节软骨磨损,软骨细胞数量增多且排列有序。与骨健组、MSC-EXO组相比,骨健MSC-EXO组小鼠的关节软骨表面光滑,软骨细胞数量增多且排列更为有序。③小鼠膝关节软骨组织中Col2A1表达水平检测结果。假手术组、骨健组、MSC-EXO组、骨健MSC-EXO组小鼠膝关节软骨组织中Col2A1阳性表达面积比均大于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000),骨健MSC-EXO组小鼠膝关节软骨组织中Col2A1阳性表达面积比大于骨健组和MSC-EXO组(P=0.000,P=0.000)。结论:骨健口服液联合MSC-EXO可改善KOA小鼠的关节软骨病理状态及软骨下骨的异常微结构,并显示出协同治疗作用,其作用机制可能与上调膝关节软骨组织中Col2A1的表达有关。

基于网络药理学及体外细胞实验分析生姜泻心汤治疗溃疡性结肠炎的潜在作用

目的:基于网络药理学及体外细胞实验分析生姜泻心汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的潜在作用。方法:运用中医系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)筛选生姜泻心汤的活性成分及相关靶点,利用GeneGards、在线人类孟德尔遗传(OMIM)、药物遗传学和药物基因组学知识库(PharmGkb)、治疗靶点数据库(TTD)和开放数据药物和药物靶标数据库(DrugBank)筛选UC疾病靶点,将药物靶点与疾病靶点匹配所得交集靶点导入互作基因/蛋白质检索工具(STRING)数据库构建蛋白相互作用(PPI)网络,并构建药物-成分-靶点-疾病网络。采用分子对接分析核心靶点和活性成分结合力,并通过脂多糖(LPS)诱导人结直肠腺癌细胞(Caco2细胞)损伤模型,给予生姜泻心汤干预24 h后,采用qPCR和免疫荧光探索生姜泻心汤对核心靶点的作用。结果:生姜泻心汤治疗UC的有效成分共215个,靶点171个,其中潜在核心有效成分为姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素;核心靶点包括HIF1A、STAT3、CTNNB1、CASP3、AKT1、IL-1β、TP53、EGFR和JUN。分子对接结果显示,AKT1、TP53和IL-1β与姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素均有较强的结合能力。细胞实验发现,生姜泻心汤干预LPS刺激Caco2细胞模型,能显著地抑制AKT1、TP53和IL-1β基因和蛋白的表达。结论:生姜泻心汤能够调控AKT1、TP53和IL-1β等靶点,发挥治疗UC的作用。

基于网络药理学方法探析汉黄芩素治疗肝细胞癌作用机制和体外实验研究

背景肝细胞癌是癌症相关死亡的主要原因,目前的防治形势依然严峻,对新的肝细胞癌治疗药物进行探索研究具有科学意义。目的通过网络药理学方法分析汉黄芩素干预肝细胞癌的作用机制,并进行体外实验验证。方法在TCMSP数据库中检索汉黄芩素的药物靶点,从TTD、Gen Card、OMIM、Dis Gent数据库中收集肝细胞癌的疾病靶点。将收集的药物靶点和疾病靶点取交集,作为药物干预疾病的潜在靶点。对交集靶点运用R软件进行富集分析,使用STRING数据库和Cytoscape软件对交集靶点构建蛋白互作网络和筛选核心靶点。在GIEPA数据库对核心靶点行进一步分析。最后通过体外实验对前期分析结果进行验证:采用CCK-8试剂盒测定细胞活性;采用平板克隆形成实验测定细胞增殖;采用划痕实验测定细胞迁移;采用Western-blotting(WB)实验测定蛋白质表达水平。结果分析结果发现汉黄芩素的吸收、分布、代谢、排泄特性符合小分子药物成药规则并且毒性分析结果表明无毒性。收集到汉黄芩素靶点135个,肝细胞癌靶点8238个,两者交集靶点113个。通过对构建的蛋白互作网络筛选出的前10位的核心基因进行分析,发现细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)在肝细胞癌组织中m RNA水平较正常肝组织上调(P<0.05),并且在肝细胞癌患者中高表达与不良预后相关(P<0.05)。KEGG富集分析发现交集基因富集在PI3K/AKT信号通路上最多,分子对接结果显示汉黄芩素与CDK1、SRC结合构型活力较强。CCK-8试剂盒检测结果显示,加入汉黄芩素75.0、150.0、300.0μmol/L组Hep G2细胞活性均低于对照组(P<0.05);平板克隆形成实验结果显示,加入汉黄芩素37.5、75.0、150.0μmol/L组Hep G2细胞克隆形成数均低于对照组(P<0.05);划痕实验结果表明,加入汉黄芩素37.5、75.0、150.0μmol/L组Hep G2细胞迁移率均低于对照组(P<0.05);WB实验结果表明,加入汉黄芩素75.0、150.0μmol/L组PI3K、P-AKT/AKT、CDK1、SRC蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。结论汉黄芩素通过下调CDK1、SRC蛋白表达,减弱PI3K/AKT通路信号,抑制肝癌细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,从而达到干预肝细胞癌发生和进展的目的。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体调控血管内皮生长因子对小鼠胫骨骨折的修复作用研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(huc-MSC)来源外泌体(Exo)对小鼠胫骨骨折的修复作用及可能机制。方法于2018年12月至2022年1月,体外分离、培养hucMSCs,超速离心法收集Exo并鉴定。24只8周龄雄性C57BL/6J小鼠行胫骨骨折,并采用随机数字表法分为模型对照组、磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组及huc-MSC-Exo组,每组各8只,其中huc-MSC-Exo组小鼠骨髓腔内注射huc-MSC-Exo(100μg溶解于100μL PBS),PBS对照组小鼠注射等量PBS,模型对照组小鼠不进行处理。21 d后,X线观察骨折愈合情况;双能X线检测骨矿物质密度(BMD);苏木精-伊红(HE)染色观察胫骨组织学变化;免疫组织化学染色检测骨折区骨组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)阳性表达情况;蛋白质印迹法检测骨折区骨组织中VEGFA、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨形成蛋白2(BMP-2)和骨桥蛋白(OPN)蛋白表达水平。结果经鉴定,成功提取huc-MSC-Exo;模型对照组和PBS对照组小鼠胫骨骨折断端明显、骨膜增厚,骨折带的两侧可见大量未分化的间充质细胞及部分软骨细胞,骨痂的软骨内骨区域软骨细胞形态肥大,而huc-MSC-Exo组小鼠胫骨骨折区愈合明显,外侧骨皮质连续性良好,部分软骨细胞已被吸收,膜内成骨区域出现骨痂;另与模型对照组(VEGFA 0.23±0.02)比较,PBS对照组(VEGFA 0.24±0.02)无明显变化(P>0.05),huc-MSC-Exo组小鼠胫骨骨折断端恢复良好,骨折线基本消失,同时骨折愈合评分、BMD、VEGFA IRS评分、VEGFA(0.48±0.04)、RUNX2、BMP-2和OPN蛋白相对表达水平均升高(P<0.05)。结论huc-MSC-Exo可加快小鼠胫骨骨折修复,其作用机制可能与提高VEGFA表达水平,促进血管生成有关。

术后腹腔粘连形成机制及间充质干细胞外泌体的治疗前景

背景:术后腹腔粘连的形成是一个复杂的过程,预防术后粘连是临床上亟待解决的问题。目的:旨在从细胞及分子水平分析粘连的发生机制,为间充质干细胞外泌体预防和治疗粘连提供理论依据。方法:以“腹腔粘连,盆腔粘连,术后粘连,上皮间充质转化,间充质干细胞,干细胞外泌体,间充质干细胞外泌体”为中文检索词,以“Abdominal adhesion,pelvic adhesion,postoperative adhesion,epithelial mesenchymal transformation,mesenchymal stem cell,stem cell exosomes,mesenchymal stem cell exosomes”为英文检索词,检索PubMed、中国知网和中国生物医学文献数据库,筛选各数据库建库至2023年8月发表的术后腹腔粘连及间充质干细胞外泌体干预研究的相关文章,并进行系统的整理分析,最终纳入54篇文献进行综述。结果与结论:(1)任何腹膜炎症、机械损伤、组织缺血和异物植入等病理因素均可引起腹膜表面的损伤,引起术后腹腔粘连;腹腔粘连的形成过程包括腹膜间皮细胞修复、炎性反应、纤溶系统及凝血途径等过程的相互作用,涉及多种细胞因子及信号通路,包括Wnt/β-catenin通路能诱导纤维化和血管生成,并与转化生长因子β/Smads信号通路相互协同,能刺激成纤维细胞增殖,引起腹膜纤维化;同时,核转录因子kB信号通路上调细胞炎症因子的表达,促进成纤维细胞增生,组织纤维化的过程中发挥关键作用。(2)干细胞的旁分泌功能是目前以再生医学为基础的分子干预腹腔粘连的重要方向,可以参与作用于腹腔粘连中的多种复杂细胞因子及信号通路。(3)相对于传统治疗腹腔粘连的方法,间充质干细胞外泌体具有生物活性、使用安全、无需特殊培养和扩增、更低的免疫原性及较长的稳定性等优势,能通过多种途径引导一种正常的修复和愈合。(4)间充质干细胞外泌体在以往研究中均被证明可以参与调节粘连形成的上述各过程,在临床研究中显示出潜在的应用前景,但需要进一步临床研究以探索适当的间充质干细胞外泌体治疗方案,来解决临床转化的问题。

Notch抑制剂DAPT体外改善L02细胞脂肪变研究

目的探讨Notch抑制剂(DAPT)体外对脂肪变肝细胞细胞炎症因子及脂质相关基因水平的影响。方法采用棕榈酸(PA)干预体外构建肝细胞脂肪变模型,采用不同浓度的DAPT干预。采用CCK-8检测细胞存活率,采用尼罗红染色了解细胞脂滴量,采用RT-qPCR法检测TNF-α、IL-1β和IL-6和脂肪相关因子【固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)、FASN和ACACA】mRNA水平,采用Western blot法检测细胞p65和SREBP1c蛋白表达。结果在无PA干预的L02细胞,经1μM、2μM、5μM和10μM DAPT处理细胞24 h,细胞存活率均较对照组显著下降(分别为85.2±5.3%、84.6±2.9%、84.4±6.0%和84.5±3.2%对100.0%,P均<0.05);经2μM和5μM浓度的DAPT干预,细胞TNF-αmRNA水平分别为(0.6±0.01)和(0.5±0.1),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.01】,IL-1β水平分别为(0.7±0.2)和(0.4±0.0),显著低于对照组【(1.1±0.1),P<0.01】,IL-6水平分别为(0.8±0.1)和(0.6±0.1),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.05】,细胞p65蛋白表达量也显著降低(P<0.05);2μM、5μM和10μM DAPT处理细胞脂滴荧光强度较对照组显著减弱【分别为(0.2±0.1)、(0.3±0.0)和(0.1±0.0)对(0.7±0.0),P均<0.001】,2μM和5μM DAPT处理细胞FASN mRNA水平分别为(0.7±0.0)和(0.4±0.1),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.001】、ACACA mRNA水平分别为(0.6±0.1)和(0.3±0.0),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.001】;5μM DAPT处理细胞SREBP1c蛋白表达量显著低于对照组(P<0.01)。结论DAPT能有效降低体外脂肪变细胞炎症因子表达量,缓解细胞内脂滴形成,其机制可能与调控脂肪相关因子的表达有关,提示抑制Notch信号通路有改善细胞脂肪变发生和进展的潜力。

Box-Behnken响应面法优化羟基红花黄色素A纳米粒处方工艺及体外释放评价

目的优化羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)纳米粒制备工艺,并对其进行体外释放评价。方法以乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA]为载体,利用改良的复乳法制备HSYA纳米粒,通过Plackett-Burman设计实验联用Box-Behnken响应面法优选最佳制备工艺;利用粒径测定仪、TEM扫描电镜仪、傅里叶红外光谱(FT-IR)仪、X-射线粉末衍射(XRD)仪对纳米粒进行表征;并对其进行4℃储藏稳定性、生理介质中稳定性、冻干保护剂及体外释放率考察。结果优选出纳米粒最佳工艺处方为:pH为6.95,投药量为2.8 mg,载体用量为18.2 mg;在此条件下制备出的纳米粒粒径为(176.4±1.29)nm,多分散系数(Polydiseperse Index,PDI)为(0.152±0.014),Zeta电位为(-17.6±0.46)mV,包封率为(78.5±0.49)%,载药量为(7.3±0.07)%,纳米粒形态圆整,分散性好;在4℃储存环境下、不同生理介质中稳定性良好,最佳冻干保护剂为1%葡萄糖;纳米粒48 h体外释放率为85%。结论该优化方法合理可靠,所得纳米粒稳定性良好,具有一定的缓释作用,体外释放符合一级动力学模型。

术后谵妄小鼠外周血源性外泌体对BV2小胶质细胞的影响

目的 探讨术后谵妄(postoperative delirium,POD)小鼠外周血源性外泌体对BV2小胶质细胞的影响。方法 选择12~14月龄的C57BL/6J雄性小鼠16只,随机分为空白对照组(Con组)和POD组,采用莫里斯水迷宫和Y迷宫实验评价POD模型是否建立成功,随后采用纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜和Western blot法对血清中的外泌体进行鉴定,用PKH26染料标记外泌体。将BV2细胞随机分为对照组(Nor组)、正常小鼠外周血源性外泌体组(Con-Exo组)和麻醉/手术小鼠外周血源性外泌体组(POD-Exo组),共孵育24 h后,采用CCK-8法检测各组细胞的活性,RT-qPCR和Western blot检测IL-1β、IL-6和TNF-α的相对mRNA和蛋白的表达。结果 与Con组相比,POD组小鼠的认知能力下降(P<0.05);共聚焦显微镜下观察到BV2细胞能够内吞被PKH26染料标记的外泌体;与Nor组和Con-Exo组比较,POD-Exo组BV2细胞活性下降(P<0.001),促炎因子IL-1β、IL-6和TNT-α的mRNA和蛋白表达均上升(P均<0.001)。结论 POD小鼠外周血源性Exo可诱导BV2细胞炎症反应。

miR-155调控巨噬细胞极化并经外泌体介导足细胞损伤的作用机制研究

目的探讨miR-155调控巨噬细胞极化并经外泌体介导足细胞损伤的作用机制。方法选择巨噬细胞RAW264.7和肾小球足细胞MPC5进行实验。将miR-155mimics、miR-155mimicsNC、miR-155inhibitor和miR-155inhibitorNC慢病毒转染至RAW264.7细胞,构建miR-155过表达/低表达巨噬细胞系及其对照,分离巨噬细胞外泌体。采用流式细胞术检测各组巨噬细胞M1/M2表型比值。采用Transwell法将RAW264.7细胞与MPC5细胞进行共培养,分别于共培养12h、24h后采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测巨噬细胞miR-155表达水平;采用Westernblot法检测巨噬细胞IL-6、IL-10表达水平,以及肾小球足细胞synaptoporin和nephrin表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾小球足细胞IL-1β、IL-10表达水平;采用TUNEL染色法检测肾小球足细胞凋亡情况。结果成功构建miR-155过表达/低表达巨噬细胞系并分离其外泌体。miR-155过表达可诱导巨噬细胞极化为M1型,抑制miR-155可诱导巨噬细胞极化为M2型。在miR-155mimics慢病毒转染至巨噬细胞24h后,其miR-155表达水平显著增加(P<0.05),并上调IL-6的表达水平(P<0.05),抑制IL-10的表达水平(P<0.05),经Transwell共培养使足细胞synaptoporin、nephrin表达水平下降(P<0.05),IL-1β表达水平升高(P<0.05),并促进足细胞发生凋亡。而转染miR-155inhibitor慢病毒至巨噬细胞后所得结果趋势与miR-155mimics相反。RT-qPCR检测结果显示,miR-155mimics组巨噬细胞外泌体中miR-155水平显著升高(P<0.05),miR-155inhibitor组巨噬细胞外泌体中miR-155水平显著降低(P<0.05)。结论miR-155过表达可诱导巨噬细胞极化为M1型,并通过外泌体介导引发足细胞损伤,而下调miR-155表达则逆转这一作用。

基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨黄芩汤治疗肝癌的作用机制

目的:采用网络药理学、分子对接技术及体外实验研究黄芩汤治疗肝癌的潜在作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索黄芩汤中黄芩、芍药、大枣、甘草的活性成分及靶点,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为条件进行筛选,使用Uniprot数据库进行靶点预测。以“liver cancer”为检索词,利用GeneCards、OMIM、DrugBank数据库获取疾病靶点,将药物的作用靶点与疾病的靶点通过韦恩图取交集,利用String数据库构建PPI蛋白互作网络图,将导出tsv数据文件导入Cytoscape 3.8.2软件,进一步筛选出核心靶点;将疾病、药物靶点导入Cytoscape软件,构建药物PPI与疾病PPI蛋白互作网络拓扑图,筛选出核心靶点。利用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-靶点”网络图;利用DAVID数据库对共同靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用Python脚本和AutoDuck Vina 1.2.0软件对黄芩汤的核心成分与关键靶点进行分子对接,计算结合力值。体外实验通过CCK-8检测HepG2增殖,TUNEL染色检测凋亡,q-PCR检测核心靶点mRNA的水平,Western blotting实验对预测通路进行验证。结果:从黄芩汤中筛选出有效成分160个,对应的活性靶点为238个。疾病对应靶点筛选去重后为1 474个,利用韦恩图将药物有效成分与疾病靶点取交集,交集数目为120个;KEGG通路富集分析得到PI3K-AKT信号通路、癌症信号通路、乙型肝炎信号通路、AGE-RAGE信号通路、丙型肝炎信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等信号通路。生物过程(BP)主要包括对基因表达的正向调节、基因表达的负向调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、凋亡过程的负调控、凋亡过程的正向调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应等。分子对接结果表明,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、黄芩素与TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA等关键靶点蛋白的分子对接结合力值均较稳定。细胞实验表明,黄芩汤含药血清能抑制HepG2细胞的增殖和抗凋亡能力,上调TP53 mRNA、CASP3 mRNA、PTEN mRNA表达,下调AKT1 mRNA表达,降低p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平。结论:黄芩汤治疗肝癌的作用机制主要是通过增强抑癌基因PTEN的表达活性,下调p-PI3K、p-AKT表达,从而抑制PI3K/AKT信号通路,诱导肝癌细胞凋亡来减弱HepG2细胞增殖能力。

微血管内皮细胞来源的外泌体对血管性痴呆模型小鼠脑血管形成及神经损伤的作用研究

目的:探究微血管内皮细胞来源的外泌体对血管性痴呆(VD)模型小鼠脑血管形及神经损伤修复的影响。方法:采用超高速离心法提取小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3的外泌体,透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态,纳米颗粒追踪分析(NTA)测定外泌体径粒分布情况,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)测定外泌体标志蛋白CD 63、TSG101、Alix表达;将40只小鼠按照随机数字表法分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、外泌体(b-Exo)组、阳性对照(DP)组,每组10只,除假手术组,其余3组小鼠均采用双侧颈总动脉缩窄法构建VD模型,b-Exo组腹腔注射100μL的b-Exo(100μg/mL),DP组腹腔注射盐酸多奈哌齐(1 mg/kg),假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水,每日1次,持续28 d;Morris水迷宫行为学实验分析小鼠学习记忆能力,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠海马组织病理学变化,免疫荧光染色检测小鼠脑组织血管形成情况,Western Blot检测小鼠海马组织中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达水平,免疫荧光染色检测小鼠海马组织中神经元特异核蛋白(NeuN)表达,酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清脑损伤相关因子星形胶质源性蛋白(S-100β)与神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平。结果:从bEnd.3细胞分离的颗粒物呈圆形囊泡状,CD 63、TSG101及Alix蛋白均高表达,说明该颗粒物为外泌体,记为b-Exo;与假手术组比较,模型组小鼠逃避潜伏期延长,通过目标象限次数和在目标象限停留时间百分比减少,海马CA1区神经元细胞数量减少,出现明显病理学损伤,血管形成减少,VEGF蛋白相对表达量下调,NeuN表达减少,血清S-100β与NSE水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,b-Exo组和DP组小鼠逃避潜伏期缩短,通过目标象限次数和在目标象限停留时间百分比增加,海马CA1区损伤明显减轻,神经元细胞数量有所增加,血管形成增加,VEGF蛋白相对表达量上调(P<0.05),NeuN表达增加,同时,血清中S-100β与NSE水平降低(P<0.05)。结论:微血管内皮细胞来源的外泌体能明显促进VD小鼠的血管形成,并修复神经损伤,对VD小鼠起到治疗作用。

间充质干细胞及其外泌体在治疗ALI/ARDS中的机制研究进展

间充质干细胞(MSC)因其显著的免疫调节能力及再生能力,已在多种疾病的细胞治疗领域显示出巨大前景,特别是在急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的治疗中表现出极高的应用潜力。ALI/ARDS均为严重的肺部炎症状态,常导致高病死率。MSC能通过分泌MSC来源的外泌体(MSC-EXO)——一种富含蛋白质、RNA及其他生物分子的微小囊泡发挥其治疗效应。在ALI/ARDS治疗中,MSC-EXO通过多种信号通路发挥作用,包括抑制核转录因子-κB(NF-κB)通路以降低炎症反应,激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路促进细胞存活,及调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)通路以支持肺组织的修复和再生等。因此,MSC和MSC-EXO的研究与应用不仅开辟了新的治疗策略,也为深入理解ALI/ARDS的复杂病理生理机制提供了重要视角。

调整细胞培养条件提高间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的潜能

背景:间充质干细胞外泌体有望发展成为治疗骨关节炎的无细胞疗法,而通过调整细胞培养条件,可以进一步提高其治疗活性和临床转化潜能。目的:综述分析细胞培养条件对外泌体活性的影响,分析其临床转化潜力。方法:查阅国内外有关骨关节炎/软骨损伤修复与间充质干细胞来源外泌体的文献。检索词分别为“外泌体,间充质干细胞,骨关节炎,软骨修复”和“exosomes,extracellular vesicles,mesenchymal stem cells,osteoarthritis,cartilage repair”,检索数据库分别为PubMed和中国知网数据库,检索时限为2010-2023年,最后纳入100篇文献进行总结和分析。结果与结论:(1)在间充质干细胞的培养过程中,提供有利于软骨细胞生长的物理环境,或添加软骨保护小分子、成软骨诱导因子和炎症因子等刺激细胞,可以进一步提高间充质干细胞外泌体在维持软骨细胞表型、促进软骨再生和免疫抑制等方面的调控活性;因此,其他具有相似特征的物理或化学因素,也有可能提升间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的疗效。(2)低氧诱导、脉冲电磁场刺激、生物反应器及软骨保护分子(如人甲状旁腺素1-34)刺激等细胞培养方案具有安全、可规模化生产等优点,可用于制备临床用途的、疗效好的间充质干细胞外泌体。(3)间充质干细胞外泌体有望实现骨关节炎的修正治疗,通过调整细胞培养方案提升治疗活性,可进一步提高其临床转化的可行性。

左归丸靶向C-X-C趋化因子受体4对人脐带间充质干细胞体外迁移的影响

目的:探讨左归丸通过靶向调控C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)表达对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外迁移的影响。方法:采用组织块法分离培养hUC-MSCs并进行流式鉴定。利用CCK-8检测不同浓度左归丸对hUC-MSCs增殖的影响,细胞划痕和Transwell实验分析左归丸对hUC-MSCs体外迁移的影响,实时聚合酶链反应(PCR)、蛋白印迹法和流式细胞术分析hUC-MSCs中CXCR4表达变化。结果:流式细胞术结果显示,hUC-MSCs表面高表达CD73和CD90,极低表达CD34和CD45。CCK-8结果显示,0.1、0.2 mg/mL左归丸均能明显促进hUC-MSCs增殖(P<0.05)。细胞划痕和Transwell实验结果显示,0.1、0.2 mg/mL左归丸能明显促进hUC-MSCs迁移,最佳浓度为0.2 mg/mL,CXCR4拮抗剂普乐沙福则能抑制其促迁移作用(P<0.05)。实时PCR、蛋白印迹法和流式细胞术结果显示,左归丸能上调hUC-MSCs中CXCR4 mRNA和蛋白表达水平,并促进CXCR4蛋白在细胞膜表达(P<0.05)。结论:左归丸通过上调CXCR4表达促进hUC-MSCs的体外迁移。

体外冲击波疗法对膝关节骨性关节炎大鼠滑膜和软骨组织炎症因子的影响及机制

目的 探讨体外冲击波疗法(ESWT)对膝关节骨性关节炎(KOA)大鼠滑膜及软骨组织炎症因子的影响及机制。方法 30只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠随机均分为对照组、模型组及冲击波组,对照组大鼠右侧关节腔注射50μL生理盐水,模型组与冲击波组大鼠右侧膝关节腔注射碘乙酸钠(MIA)2 mg/50μL构建KOA模型,均干预14 d;干预结束后对照组、模型组大鼠行冲击波声音刺激,冲击波组大鼠予ESWT治疗,1次/周、共4周;分别于术前和术后第3、7、14、21、28、35及42天,采用热刺痛仪和足底刺痛仪检测各组大鼠右后爪的热缩爪潜伏期(PWTL)和足底机械刺激缩足阈值(MWT);术后第42天,各组大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉,行右膝关节X线检查,然后处死、取右侧膝关节,采用免疫组织化学法(IHC)检测各组大鼠膝关节滑膜和软骨组织白细胞介素-1β (IL-1β)、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。结果 模型组和冲击波组大鼠术后第3~42天的PWTL均较对照组缩短(P<0.05),冲击波组大鼠术后第28~42天的PWTL较模型组延长(P<0.05);模型组与冲击波组大鼠术后第3~42天的MWT均较对照组降低(P<0.05),冲击波组大鼠术后第21~42天MWT较模型组升高(P<0.05);与对照组比较,模型组与冲击波组大鼠关节间隙变窄,关节面粗糙变形程度较重,膝关节对线不齐,关节边缘有骨赘形成,且冲击波组上述X线表现轻于模型组;3组大鼠膝关节滑膜组织、软骨组织TNF-α、IL-1β及IL-6水平比较,对照组<冲击波组<模型组(P<0.05)。结论 ESWT可缓解KOA大鼠痛觉敏化症状及KOA疾病进展,其机制可能与减少滑膜和软骨组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的表达有关。

前列腺癌“劫持”肿瘤相关成纤维细胞通过外泌体MALAT1调控糖代谢重编程的机制研究

目的:阐明外泌体转移性肺腺癌相关转录因子1(MALAT1)介导的前列腺癌(PCa)细胞与癌相关成纤维细胞(CAFs)间相互作用,探究CAFs来源的外泌体MALAT1在PCa糖代谢重编程中的作用及其机制。方法:分析肿瘤基因组图谱(TCGA)资料,探讨MALAT1在多种肿瘤中的表达模式,尤其是其与PCa的临床关联性。运用单细胞RNA测序(scRNA-seq)及相关技术,研究MALAT1在介导PCa细胞与CAFs之间相互作用的机制。过表达CAFs细胞中的MALAT1,提取上清外泌体,并与PCa细胞共培养,通过RNA纯化的染色质分离—质谱(ChIRP-MS)等方法,研究外泌体MALAT1在PCa进展中的功能及作用机制。结果:利用TCGA数据集进行分析,观察到MALAT1与前列腺腺癌、乳腺浸润癌、胆管癌等多种肿瘤恶性程度相关,且与PCa不良预后相关。scRNA-seq分析显示,PCa肿瘤微环境细胞中的CAFs不仅存在PCa分子标记物KLK3,而且MALAT1在CAFs中的表达显著高于PCa细胞,提示PCa细胞能够“驯化”CAFs,并通过CAFs中MALAT1促进PCa进展。进一步地,共培养和ChIRP-MS实验发现外泌体MALAT1通过与PCa糖代谢关键酶的直接结合调控PCa的能量代谢。ChIRP-MS和RNAseq联合分析发现外泌体MALAT1能够与4个糖酵解关键基因(GPI、ALDOC、PGK1、ALDOA)直接结合,从而调控PCa细胞的糖代谢重编程。结论:PCa细胞能够“驯化”CAFs,并通过CAFs释放外泌体MALAT1直接作用于PCa糖酵解关键分子,从而调控糖代谢重编程加速PCa发展。

功能化外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠治疗的研究

目的:探究负载髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的293F细胞来源的外泌体(EXO)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果。方法:利用Western印迹、透射电子显微镜以及Nanosight对超速离心分离的293F细胞上清EXO进行表征;利用流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞摄取EXO的生物学功能;利用EXO特异性锚定肽EXP将MOG抗原肽修饰于EXO表面,流式细胞术检测EXO与MOG抗原肽的结合效率(EXO_(MOG));活体成像检测EXO_(MOG)的体内分布;利用小鼠的临床评分、体重变化以及收样时小鼠脾细胞中调节性T细胞变化和脊髓染色,评估EXO_(MOG)对EAE小鼠的治疗效果;利用组织形态学染色检测EXO_(MOG)治疗对各组小鼠不良反应。结果:超速离心可成功分离EXO,且分离的EXO具有被细胞摄取的生物学功能;EXP外泌体锚定肽介导MOG抗原肽高效负载于EXO表面,且不影响EXO的体内分布;在EAE小鼠上测试结果显示:与未治疗组和MOG组相比,EXO_(MOG)组小鼠治疗后第24天的体重显著增加(P<0.05),行为学评分显著降低(P<0.05),且治疗后小鼠脾脏中CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞显著增高(P<0.05);病理染色结果表明:EXO_(MOG)组小鼠的各组织器官未见明显病理学改变。结论:EXO_(MOG)能够有效缓解小鼠EAE疾病进展且未检测到相关不良反应。

γ-干扰素体外释放试验在结核病诊断中的临床价值

探讨γ-干扰素(IFN-γ)体外释放试验(TB-IGRA)在结核病诊断中的临床价值。方 法 以2023年1月至2023年12月间在梧州市某医院进行TB-IGRA检测的150例患者(其中包括30例正常对照者)作为研究对象。查看其病例与临床资料,并与抗酸杆菌检测(液基夹层杯)、结核菌培养、结核抗体检测(TB-AB)比较其检测的灵敏度和特异性。结果 在150名被选取的患者中,已确诊为结核病的有64例(肺结核41例,肺外结核23例),其中IGRA57例为阳性,灵敏度较高,可达到89.06%。肺部感染引起的结核与肺外其他组织器官感染所引起的结核在阳性检出率上来进行比较,并没有显著性差异(P>0.05);TB-IGRA试验的阳性检出率要明显高于本次试验中的其他三种检测方式。本次试验中临床资料确诊为非结核的病例为86例(包括确诊肺部感染或其他疾病者56例和30例健康对照者),其中71例通过TB-IGRA测定的结果为阴性,特异性为82.56%。结论 γ-干扰素体外释放试验对检测各种结核病具有取材方便、检测快速、灵敏度高、特异性好等优点;临床应用价值较高,值得在临床应用和推广。