体外翻译系统在分子生物学研究中的应用

体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统 ,是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白质快速分析鉴定 ,基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究 ,如蛋白质和蛋白质的相互作用 ,蛋白质与 DNA的相互作用 ,蛋白质与

可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达

目的构建能在体外大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的pET28a-EGFP原核表达载体。方法以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,EcoR I和Hind III双酶切EGFP基因序列和pET28a载体。T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定。将pET28a-EGFP转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,观察荧光。体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP载体,孵育后观察荧光。免疫印迹法(Western blott)鉴定EGFP。结果测序证实pET28a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠埃希菌BL21(DE3)和体外翻译系统中强烈荧光,West-ern blot结果显示相对分子质量约为27 000的EGFP高效表达。结论成功构建了能在体内和体外稳定表达的可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步体外筛选抑菌药物提供了可靠的报告载体。

DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白(内含子C端-外显子-生物素结合蛋白)形成DNA-蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体(Flag-内含子N端)发生剪接反应的DNA-蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签(Flag),从而被抗旗帜标签抗体纯化柱(Anti Flag antibody M2 agarose)筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA-蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因"突变库",即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。

靶向23S rRNA的多肽核酸体外抑制细菌蛋白翻译

目的 尝试研究反义多肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）在体外翻译系统中抑制细菌蛋白的翻译。方法以增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）为报告分子，将重组载体pET-28a—EGFP和靶向23S rRNA domainⅡ区的PNA在体外翻译系统中共同孵育后，用荧光显微镜观察荧光强度减弱，放射自显影证明荧光强度减弱是因为EGFP减少。为了分析PNA体外抑制蛋白翻译的浓度，我们用蛋白沉淀方法分析PNA体外抑制[^35S]methionine渗入蛋白比例。最后，用浊度分析观察PNA（G1138）在MH肉汤培养基中的抑菌作用。结果在体外翻译系统中，靶向23S rRNA do-mainⅡ区的PNA（G1138）以剂量和序列依赖方式抑制蛋白合成，抑制浓度（IC50）为0．15μmol／L。在MH培养基中，PNA（G1138）抑菌效果不明显（MIC〉50μmol／L）。结论靶向23S rRNA domainⅡ区的PNA（G1138）在体外翻译系统中能有效抑制细菌蛋白合成。在MH肉汤培养基中，PNA（G1138）抑菌效果不明显。

TNF-α的合成分泌机制不同于一般的分泌型蛋白

目的拟借助微粒体膜和体外转录翻译系统来研究分泌型ＴＮＦα（Ｓ－ＴＮＦ－α）的产生机制及Ｓ－ＴＮＦ－α和跨膜型ＴＮＦα（ＴＭ－ＴＮＦ－α）的关系。方法首先将分子量为１７×１０３Ｓ－ＴＮＦ（不含编码ＴＮＦ信号肽的基因）、２６×１０３ＴＭ－ＴＮＦ（含信号肽基因）和１７×１０３Ｓ－ＴＮＦ突变体（Ｓ－ＴＮＦｍ，用ＩＬ－２信号肽密码子置换ＴＮＦ信号肽序列）的全长ｃＤＮＡ片段分别亚克隆于含Ｔ７启动子的ｐＧＥＭ－３Ｚｆ载体，然后利用体外转录翻译系统，在微粒体膜存在和不存在的情况下，体外翻译合成Ｓ－ＴＮＦ、ＴＭ－ＴＮＦ及其Ｓ－ＴＮＦｍ。结果经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明：微粒体的存在并不改变２６×１０３ＴＭ－ＴＮＦ的分子量，但微粒体的存在能将Ｓ－ＴＮＦｍ上的ＩＬ－２信号肽切除，证实ＴＮＦ引导序列与一般分泌性蛋白的“信号肽”不同，在粗面内质网翻译过程中不被切除。进一步酶切分析表明ＴＭ－ＴＮＦ是通过某些金属蛋白酶酶解作用而被转换成Ｓ－ＴＮＦ的。结论实验结果提示１７×１０３Ｓ－ＴＮＦ产生机制可能是：ＴＮＦ产生细胞经ＬＰＳ等激活后，导致ＴＮＦ基因转录翻译增加，首先形成２６×１０３ＴＮＦ，并借助其信号肽疏水氨基酸部分将之“锚定”?