假尿苷修饰体外转录mRNA在翻译过程中发生的+1核糖体框架移码

为应对世界范围内的COVID-19疫情,假尿苷(Ψ)修饰的体外转录mRNA(Ψ-IVT-mRNA)被授权应用于SARS-Cov-2 mRNA疫苗。最近,Ψ-IVT-mRNA被发现在翻译蛋白质时发生核糖体“滞顿”,导致+1核糖体移码,在体外和体内翻译出异常的蛋白质。在接种SARS-Cov-2 mRNA疫苗的人群,这种异常蛋白可能激发脱靶T细胞反应或抗体反应或产生其它意想不到的副作用。这一发现对研制有效“安全”的mRNA疫苗/药物有“警示”和指导意义。

体外转录 mRNA 药物及其在肿瘤免疫治疗中的应用

体外转录(IVT)mRNA是以DNA为模板,转录指导合成相应蛋白质,可以在体内细胞中传递遗传信息。应用特定的IVT mRNA可通过宿主细胞的翻译机制表达产生免疫原蛋白或治疗性蛋白,促使机体产生免疫反应或对机体产生治疗效应,因此在临床上能够干预疾病进程。近年来,随着mRNA工程技术的发展,IVT mRNA作为一种具有较好应用前景的潜在药物,逐渐成为研究热点。其中在肿瘤免疫治疗领域中,IVT mRNA药物可以作为癌症疫苗,快速表达癌症抗原,产生抗体后杀死体内癌细胞,从而达到预防和治疗肿瘤的目的,该类研究已经取得了较大进展。本文系统介绍mRNA药物结构特点、独特优势及其在肿瘤免疫治疗中的临床应用。

低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究

目的 :探讨低氧对大鼠脑线粒体DNA表达的影响及其与能量生成的关系。方法 :雄性Wistar大鼠随机分为 3组 :急性低氧组 (AH)、慢性低氧组 (CH)和对照组 ,其中急、慢性低氧组动物分别连续暴露于模拟海拔 40 0 0m高原 3d(AH)和 40d(CH)。分离脑线粒体 ,分别测定线粒体体外转录活性、F0 F1 ATP酶活性以及ATP对线粒体体外转录的影响。结果 :急性低氧大鼠脑线粒体体外转录活性及F0 F1 ATP酶活性显著降低 ,慢性低氧时有所回升 ,两者呈线性相关。ATP对大鼠脑线粒体体外转录活性呈双相效应。结论 :低氧时脑线粒体转录活性改变可能参与低氧抑制线粒体能量代谢的机制 。

EBV-LMP1C端RNA的体外转录合成及其靶脱氧核酶的初步筛选

目的探讨用体外转录方法制备EBV-LMP1C端RNA并用该RNA对其靶脱氧核酶进行初步筛选。方法用巢式PCR方法从绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中扩增EBV-LMP1exonc,重组入pGEM-11zf载体,并用T7RNA聚合酶对其进行体外转录制备EBV-LMP1C端RNA。根据该RNA的一、二级结构设计合成3种靶向10～23脱氧核酶,据体外剪切效率筛选高效特异的靶向脱氧核酶。结果成功地构建含EBV-LMP1exonc基因的重组质粒,用体外转录方法用1μg质粒转录出40.25μg高纯度的EBV-LMP1C端RNA,有1种脱氧核酶DZ1对该RNA体外剪切效率达89%。结论用T7RNA聚合酶体外转录方法成功制备了高纯度的EBV-LMP1C端RNA,经体外剪切筛选出高效特异的1种脱氧核酶,为进一步研究奠定了基础。

猪单个卵母细胞体外转录体系的建立

利用switching mechanism at 5′end of RNA transcript(SMART)技术对猪单个体外成熟培养的MⅡ期卵母细胞进行了扩增,在此基础上,利用T7体外转录技术进行体外转录,aRNA浓度达到1.962μg。通过联合SMART技术和T7体外转录技术,mRNA浓度扩增了2.3×104倍左右,这个数量级已基本能满足cDNA array等通量筛选研究的需求。本研究为珍贵和微量的生物材料进行高通量筛选研究提供了一个有效的体系。

用T7RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNA^(Ile)

采用PCR技术从rec M1 3mp1 8中扩增出 1 2 0bp的大鼠肝tRNAIle合成基因片段 ,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板 ,利用T7RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNAIle基因 ,生成不含修饰碱基的tRNAIle,并对体外转录反应条件进行了优化 ,回收的tRNA产量可达DNA模板量的 4

组蛋白与hAMFR基因启动子的结合对体外转录活性的影响

采用从鸡血红细胞中分离纯化的组蛋白、从HeLa细胞核中革取的含有RNA聚合酶Ⅱ和多种Ⅱ类基因转录因子的可溶性抽提物，以及从非洲爪蟾卵细胞核中提取的革取物热处理物上清（HTS）用于核小体构建，以含有人自班移动因子受体（hAMFR）基因启动子序列的DNA片段为模板进行体外转录实验，结果表明，组蛋白和转录因子在hAMFR基因启动子序列上的竞争性结合对转录活性具有重要的影响作用，在启动子区域预先构建的核小体能够抑制转录活性；反之在启动于上先形成转录起始复合物则能防止核小体的转录抑制作用；当组蛋白和转录因子同时作用在DNA模板时，转录活性取决于组蛋白和转录因子的相对浓度。

体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。

H5N1禽流感病毒抗原基因的体外转录及RNA标准品构建

目的通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M(M)基因的RNA片段,为病原学检测提供阳性定量标准品。方法设计H5N1禽流感病毒的HA、NA及M基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1禽流感病毒总RNA,用RT-PCR获得相应片段,分别连接至pGEM-Teasy质粒,转化宿主菌XL10-Gold,然后提取阳性克隆的重组质粒DNA,测序鉴定后用限制性核酸内切酶NdeI酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,产物用DNase酶处理、纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M基因全长开放阅读框序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为503.9、379.2、437.8ng/μl。结论获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。

RNA干扰用siRNA的体外转录合成

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具,而获得符合干扰要求的短双链干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)是进行RNA;研究的首要步骤。本研究建立了体外转录合成siRNA方法,并用其生成的siRNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白(GFP)基因和内源3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。结果显示,siRNA能特异性降低鸡成纤维细胞中内外源基因的表达。本实验认为这种以DNA为模板体外转录合成siRNA方法操作简单、成本低、产物得率高,值得从事RNA研究者参考借鉴。

汉坦病毒S基因的克隆及体外转录

目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。

体外转录制备轮状病毒生物素核酸探针

通过体外转录将生物素化UTP掺入到轮状病毒的单链RNA中制成探针,把它与结合在硝基纤维膜上的核酸样品杂交,经亲和素一生物素化碱性磷酸酶温育,α-萘酚磷酸和固蓝盐显色后,阳性反应呈蓝紫色;轮状病毒生物素核酸探针可检测到20PgRNA靶序列。SA_(11)或NCDV探针可识别同源的SA_(11)、NCDV、Wa和Sl的核酸序列。检测141份猪、羊和人腹泻粪样,118份呈阳性。对几株细胞培养物进行了杂交试验。结果表明,生物素核酸探针具有稳定、特异。

喉癌eIF4E基因的体外转录

目的克隆喉癌eIF4E基因编码区的cDNA序列,并构建其体外转录载体,获得eIF4E基因编码区mRNA,以便进一步的体外实验研究。方法利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以喉癌Hep-2细胞mRNA为模板,扩增获得全长eIF4E编码区cDNA,与pMD18T连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建eIF4E基因mRNA体外转录载体pGEM-7zf+eIF4E。用内切酶XhoI将含有eIF4E基因mRNA的pGEM-7zf+eIF4E质粒消化成线性,以此为模板体外转录出用[a-32P]UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA。结果经测序证实获得的eIF4E基因cDNA序列与GeneBank一致,并成功构建了体外转录质粒pGEM-7zf+eIF4E。结论成功构建了体外转录质粒pGEM-7zf+eIF4E,为进一步研究eIF4E的功能奠定了基础。

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒，获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间，所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应，产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ，证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ，Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ，其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照，对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时，ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ，改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。

大鼠肝tRNA^(Ile)基因的克隆与体外转录

采用PCR扩增出大鼠肝tRNAIle基因，构建了重组质粒pGWIW，并用T7RNA聚合酶／启动子系统对其进行了体外表达．经过对转录产物片段大小及运用Northernblot鉴定，证明获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNAIle生物学活性检测显示：合成基因体外转录产物氨基酰化活性是天然tRNA的40％。

体外转录系统质粒pNI-11和pNI-12的构造

本文介绍将大鼠心房肽(ANP)前体的互补DNA(proANP—cDNA)的PstI片段再克隆到具有双向转录启动子的质粒pGEM—2中,构建了体外转录系统的质粒pNI—11和pNI—12。用限制性內切酶AccI消化重组的质粒,结合电泳比较酶谱,区别出插入段cDNA的方向。用这种质粒可以体外合成高灵度的探针,可供基因调控、原位杂交等多方面研究。判断插入基因在重组质粒中方向的方法有普遍意义。

体外转录法制备SARS冠状病毒RNA片段

目的通过体外转录获得SARS冠状病毒RNA片段,为建立RTPCR和荧光定量PCR诊断方法提供阳性对照。方法根据GenBank登录SARS冠状病毒Tor2株基因组序列,选择基因组中18138-18327nt作为目的扩增序列,并将其分解为首尾重叠的3个片段,人工合成对应的单链DNA序列,通过退火延伸获得全长dsDNA片段,PCR扩增该片段后,连接至载体pMD18T上,筛选含目的插入片段的阳性重组质粒pMD18TSARS,用BamHⅠ和HindⅢ切出目的片段,连接至线性化表达性质粒pGEM上;筛选阳性重组质粒pGEMSARS,测序鉴定后,经HindⅢ酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,得到含SARS冠状病毒目的序列的RNA片段,转录产物经电泳观察后,用RTPCR验证。结果获得含SARS冠状病毒目的基因序列的RNA片段。结论该RNA片段可用于SARS冠状病毒RTPCR和荧光定量RTPCR诊断方法的阳性对照。