体外转录mRNA系统的建立及其在呼吸道合胞病毒疫苗中的应用

目的建立mRNA的体外转录系统,并用于评价呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)mRNA疫苗的免疫效果。方法以增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为模式蛋白,将EGFP基因分别克隆入pcDNA3.1(+)和pmRV载体中,通过体外转录合成EGFP mRNA,以验证载体及mRNA框架结构的正确性;然后将RSV融合前F蛋白(RSV preF)序列构建于经验证的载体,体外转录合成RSV preF mRNA;转染细胞后,通过荧光显微镜、流式细胞术、免疫荧光和Western blot等方法验证蛋白表达;进一步通过微流控技术用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)包封体外转录合成的mRNA,经过粒径和多分散性指数检测后进行小鼠免疫和评价。结果经过验证发现,pcDNA3.1(+)的框架结构更适合mRNA;EGFP mRNA转染HEK 293T细胞24 h后,体外转染效率>90%;免疫荧光和Western blot等方法验证RSV mRNA能够在24 h内表达preF;包封后的RSV mRNA疫苗免疫小鼠,血清抗体滴度与RSV preF蛋白免疫抗体滴度相近(P>0.05),细胞因子IFN-γ和IL-4均有一定程度的上调。结论建立了正确表达目的蛋白的mRNA体外转录系统,以此为基础的RSV mRNA疫苗在小鼠体内可诱导强的免疫应答,为潜在的RSV mRNA候选疫苗奠定了基础。

DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白(内含子C端-外显子-生物素结合蛋白)形成DNA-蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体(Flag-内含子N端)发生剪接反应的DNA-蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签(Flag),从而被抗旗帜标签抗体纯化柱(Anti Flag antibody M2 agarose)筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA-蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因"突变库",即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。

H1N1亚型流感病毒mRNA候选疫苗的构建、表达及鉴定

目的从mRNA序列优化和体外转录(IVT)系统优化角度,设计2条基于血凝素(HA)基因的抗H1N1亚型流感病毒mRNA疫苗,分别连接到3种体外转录系统(含不同UTRs序列)中进行候选疫苗抗原的表达及鉴定,并确定候选疫苗所使用的最佳体外转录系统。方法确保抗原基因(HA)氨基酸序列不变,以2种优化策略对HA基因的密码子进行优化,分别命名为JLH1HA和JLHA,并分别克隆至骨架载体pGEM-T7-Hα(UTRs来自人源α球蛋白)、pGEM-T7-Mα(UTRs来自鼠源α球蛋白)、pGEM-n3(UTRs来自人源β球蛋白)上,通过线性化处理、体外转录、纯化及Cap1加帽处理,获得功能性mRNA,转染A549细胞后通过Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定目的蛋白的表达。结果成功构建6组mRNA候选疫苗且均能表达抗原蛋白,以pGEM-T7-Hα为骨架载体构建的体外转录系统蛋白表达量较高。结论抗原的设计具有可行性,筛选出的最优体外转录系统为以pGEM-T7-Hα为骨架载体构建的体外转录系统。密码子优化对蛋白表达量的影响并不显著,可能在动物免疫效果上能够体现。