体外连接法构建重组人γ干扰素腺病毒并检测其在真核细胞中的表达

背景与目的:γ干扰素(interferon-γ,IFNγ)具有直接促进某些肿瘤细胞凋亡和调节细胞免疫的功能,因此在肿瘤的基因治疗中IFNγ将发挥重要的作用。本研究构建携带人IFNγcDNA的重组腺病毒,并检测它在真核细胞中的表达。方法:用逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)从人外周血单个核细胞中扩增出IFNγ的cDNA全长序列,插入腺病毒穿梭质粒pShuttle,经酶切和DNA测序鉴定,然后用体外连接法构建重组腺病毒Ad-IFNγ。用所构建的重组Ad-IFNγ感染HepG2细胞,通过RT-PCR和免疫组织化学法检测IFNγ的表达。结果:经测序,克隆的人IFNγcDNA序列与GenBank上公布的序列完全一致;Ad-IFNγ感染的HepG2细胞在转录和翻译水平均有IFNγ的表达。结论:体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;所构建的重组腺病毒Ad-IFNγ能表达IFNγ蛋白,可用于抗肿瘤和抗病毒等细胞及动物实验。

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

【目的】构建携带 SARS 冠状病毒刺突蛋白 N 端基因片段的重组腺病毒。【方法】从 SARS 病毒 cDNA 扩增刺突蛋白 N 端基因片段(-45～1469nt,截短的 S1区,S_N),插入腺病毒穿梭质粒 pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-S_N。用 Ad-S_N 感染 Vero-E6细胞,通过 RT-PCR 和 Western blot 法检测 S_N 的表达。【结果】克隆的 S_N 基因序列与文献报道基本一致;Ad-S_N 基因组结构与预期一致。在 Ad-S_N 感染的 Vero-E6细胞中存在 S_N 基因的转录和分泌型 S_N 蛋白的表达。【结论】体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒 Ad-S_N 能正确表达分泌型 S_N 蛋白,可用于诱导抗 SARS 免疫的动物实验研究。