体外连续传代对人脐带来源间充质干细胞转录组的影响

目的分析不同代次人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSC)转录组差异,探讨体外连续传代对hUC-MSC转录组的影响。方法从无菌脐带样本中分离脐带华通胶组织于细胞培养瓶中培养,培养1周时成纤维样细胞从组织块周围爬出,消化传代后获得低代次(第3代,P3)和高代次(第15代,P15)hUC-MSC。取P3和P15hUC-MSC细胞,行免疫表型和三系分化潜能鉴定;提取细胞RNA,构建测序文库进行转录组测序,获得P3、P15hUC-MSC转录组基因表达矩阵,以校正后P<0.05且|log2FC|≥2筛选差异表达基因,并进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。为验证测序结果,采用实时荧光定量PCR法检测P3、P15hUC-MSC肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)mRNA相对表达量,采用ELISA法检测P3、P15hUC-MSC上清液TNFRSF11B蛋白水平。结果P3、P15hUC-MSC均表达CD73、CD90、CD105,均不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR;均可向成脂、成骨和成软骨细胞分化。P3、P15hUC-MSC共比对60656个基因表达情况,筛选出497个差异表达基因。与P3hUC-MSC比较,P15hUC-MSC上调基因有335个,包括TNFRSF11B、FGFR2、CCND2、WT1等;下调基因有162个,包括NFE2、IL-7R、C1QL4等。GO富集分析结果显示,差异表达基因共富集于204条GO条目,其中183条为生物过程,19条为细胞组分,2条为分子功能,主要富集于系统和器官发育、蛋白质磷酸化、细胞黏附等生物过程;细胞组分分析显示,差异表达蛋白主要富集于细胞表面及质膜等部位。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因主要富集于PI3K-Akt、RAP1信号通路、轴突导向、细胞外基质受体相互作用和癌症中蛋白多糖增加等相关通路。P15hUC-MSC TNFRSF11B mRNA相对表达量(4.484±0.018)及上清液TNFRSF11B蛋白水平[(118.925±0.475)μg/L]均高于P3hUC-MSC[1.000±0.021、(22.046±0.116)μg/L](t=49.490,P<0.001;t=343.300,P<0.001)。结论hUC-MSC体外连续传代导致转录组发生变化,异质性增加,表现为高代次hUC-MSC部分基因表达上调,主要富集于癌症相关通路。