多星韭黄酮醇合成酶基因AwFLS1的克隆及功能验证

黄酮醇合成酶(Flavonol synthase,FLS)可以催化3种二氢黄酮醇形成相对应的黄酮醇,是调控黄酮醇合成的关键酶。以多星韭(Allium wallichii)盛开期花朵为材料,提取RNA并通过反转录获得cDNA,利用PCR技术对AwFLS1基因进行克隆并完成生物信息学分析;利用qRT-PCR技术分析AwFLS1基因在多星韭花朵不同发育时期、不同组织器官的表达,初步推测其功能;构建原核表达载体BL21-pET32a(+)-AwFLS1,制备可溶性重组蛋白并进行体外酶活性鉴定。结果表明,多星韭AwFLS1基因CDS全长为1008 bp,编码335个氨基酸,推测形成一种不稳定且不定位于膜上的非分泌亲水性蛋白,分子量约为38.22 kDa,具有保守的2-酮戊二酸/FeⅡ依赖型双加氧酶结构域。AwFLS1基因在多星韭花朵不同发育时期表达量呈逐渐降低趋势,在小苞期最高;在不同组织器官中,表达量存在显著差异,在叶中表达量最高,根中表达量最低。AwFLS1重组蛋白可在体外催化3种二氢黄酮醇底物形成对应的黄酮醇,底物偏好性有待进一步验证。研究结果证实了多星韭AwFLS1在类黄酮代谢途径中的功能,为解析多星韭黄酮醇合成机制奠定了理论基础,为利用基因工程技术提高药用植物活性成分含量提供了候选的基因资源。

集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862金属蛋白酶活性的体外鉴定

【目的】金属蛋白酶S2P在细菌中通过在膜切割转录调控因子、释放δ因子参与胁迫响应是跨膜信号转导的保守机制,但蓝细菌中S2P的功能还未被鉴定,故我们考察集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862的金属蛋白酶活性。【方法】以pET-30b(+)为载体,分别构建重组质粒pF0643和pF0862,在大肠杆菌BL21(CE3)中诱导表达并纯化Slr0643及Sll0862蛋白,以β-酪蛋白为底物检测重组蛋白的酶活性。【结果】体外酶活实验显示重组表达的Slr0643及Sll0862蛋白有内切蛋白酶活性,且其活性受金属螯合剂o-phenanthroline的抑制。体外酶活的鉴定结果为进一步研究Slr0643和Sll0862的体内酶活和生物学功能奠定了基础。【结论】集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862具有金属蛋白酶活性。