组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构

目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构。方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析。用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM)。以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/LCO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况。用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式。结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株。在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3413/mm2。HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达。结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植。

破骨细胞完善类骨组织体外重建的研究

目的近来,越来越多的证据明确表明破骨细胞的调节作用对于正常的骨形成是不可或缺的。破骨细胞缺乏动物所表现出来的骨基质的无序沉积、矿化缺陷、成骨细胞的行为异常在目前的组织工程化骨中也都存在。因此,破骨细胞参与到骨修复策略中来是完善类骨组织体外重建所必须的。实验研究主要探索既符合生理过程又实际有效的破骨细胞引入途径。①成骨细胞的分化程度对前破骨细胞(融合前破骨细胞,poc)成熟的影响。②建立创新的破骨细胞在绀织工程化骨生成方法。③观察破骨细胞的生成、功能表达,以及对支架类骨结构的影响。

细胞核体外重建过程中核纤层与核膜组装的关系

核纤层Nuclear lamina是位于内层核膜下的纤维蛋白片层结构,为了研究核纤层与核膜在功能上的关系,我们利用体外核装配这一实验模式,初步探索了核纤层与核膜装配的关系。首先,我们应用噬菌体Lambda DNA和非洲爪蟾卵细胞抽提物建立了体外细胞核组装体系,体外构建的细胞核具有正常细胞核的形态结构(图1),同时证明核纤层参与了细胞核的体外组装。为进一步探讨核纤层在细胞核组装过程中的作用,我们在非细胞体系中加入足量的能与两栖类卵细胞核纤层蛋白Lamin Ⅲ反应的抬体,观察核纤层蛋白抬体对核膜组装的影响,超薄切片电镜观察显示核纤层蛋白抬体的介入导致非细胞体系中膜系组装的紊乱,不能形成正常的双层核膜,而是形成呈同心圆状排列的多层单位膜(图2)。其机制有待进一步探讨,推测核纤层蛋白单体组装成核纤层可能是细胞核组装过程中的一个重要环节,这一环节的缺失导致了膜系统,特别是双层核膜的组装异常。

利用非洲爪蟾精子染色质和卵提取物在体外重建细胞核

应用非洲爪蟾（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）去膜精子染色质和卵提取物成功地进行了细胞核体外重建。当精子染色质加入卵提取物后，首先发生染色质去浓缩作用，染色质整体结构膨胀；膜泡在膨胀的染色质外周聚集并逐渐彼此融合成双层膜；核孔复合体以某种未知方式组装入双层膜而形成核膜结构，并逐渐完全覆盖膨大的染色质，最终形成典型的间期核结构。

应用三维培养技术体外重建角膜组织的初步研究

目的 探讨三维培养技术体外重建角膜组织的理论基础及临床应用价值。方法 原代培养人角膜上皮、基质及内皮细胞 ,通过胶原凝胶三维培养系统 ,体外重建角膜结构 ,应用裂隙灯检测人工角膜的透明度 ,采用常规病理组织学及透射电镜观察细胞在三维培养系统中生长的特性。结果重建的角膜组织为良好的三层结构 :角膜上皮细胞形成复层结构 ;内皮细胞形成单层结构 ,且排列规则 ;角膜基质细胞呈散在分布。电镜观察 ,细胞在Ⅰ型胶原中存活并合成胶原纤维。结论 利用组织工程技术 ,能够体外重建结构较规则、透明度较高的角膜组织。

组织工程人角膜上皮体外重建的研究进展

从种子细胞的来源和载体支架的筛选两个方面对组织工程人角膜上皮的体外重建及其研究中所存在的问题与解决途径进行综述。

影响汗腺发育的信号通路及其参与汗腺样细胞体外重建的研究进展

大面积深度烧伤患者因汗腺毁损导致体温调节功能基本丧失,生活质量受到严重影响。目前对于修复汗腺功能的研究较多,然而人体汗腺发育的机制尚未完全阐明。越来越多的研究表明Wnt/β连环蛋白、外胚叶发育不全/外胚叶发育不全受体/核因子κB、音猬因子、叉头框转录因子等信号通路彼此级联共同影响汗腺发育,并且已有研究报道可以利用级联信号通路实现汗腺样细胞的体外重建。现就影响汗腺发育的信号通路及其参与汗腺样细胞的体外重建情况作一综述。

子宫内膜体外三维重建的形态学研究

目的 :探索建立子宫内膜体外三维模型的方法。方法 :将分离的子宫内膜基质细胞和上皮细胞依次种植于生物可降解胶原 -聚乳酸羟基乙酸共聚物杂交聚合网上下两面 ,光镜及扫描电镜观察细胞的生长状况。结果 :接种后第 5天子宫内膜细胞能在聚合网上融合生长 ,第 1 4天细胞融合成片 ,呈复层生长 ,形成三维结构。结论 :生物可降解的杂交聚合网作为支架可建立体外子宫内膜三维模型。

含黑素细胞的人体外重建皮肤模型：角质形成细胞生长因子在构成性色素沉着方面的作用

肤色是人类最显著的多态性特征之一，其形成主要原因是：黑素细胞产生黑素以及黑素经黑素细胞的树突被转移到相邻角质形成细胞中去。由一个黑素细胞和其周围约40个角质形成细胞组成的结构被称为表皮黑素单位（epidermalmelaninunit，EMU）。人与生俱来的肤色被称为构成性色素沉着（constitutivepigmentation），取决于黑素的数量与质量（褐黑素与真黑素的比例）以及角质形成细胞内黑素小体的大小、转移模式、分布和降解；而并非取决于黑素细胞的数量，

中国人体外重建表皮模型的建立和特征

皮肤作为重要的人体器官，是对机体存活至关重要的保护性屏障。皮肤可以防止体内水分及矿物质的丢失，在机体处于有害环境暴露时起到保护作用，如异物、微生物、紫外线和其他污染物。此外，皮肤具有多种功能，包括体温调节、感觉、分泌排泄、产生维生素D等。皮肤是一个具有多层结构的器官，最外层是由4层结构组成的表皮，从内到外依次为基底层、棘层、颗粒层和角质层。维持表皮的这种多层结构是保持人体皮肤防御功能所必需的。

广谱防晒剂可有效防止UVA在体外重建皮肤及人体皮肤中诱导的基因表达

UVA（320～400nm）照射与光老化、光线性皮肤病、皮肤光致癌的发生密切相关，因此应用具有UVA防护能力的广谱防晒剂非常重要。为了有效地评价防晒剂在分子水平上的生物学效应，该研究不仅将体外重建皮肤模型作为体外研究（in vitro）对象，同时又在志愿者皮肤上进行了体内研究（in vivo）。体外重建皮肤模型是由具有活性的真皮类似物和分化完全的表皮组成，可用在体外重现UVA诱导的组织特异性损伤，

使用体外重建皮肤模型研究真皮成纤维细胞对皮肤色素沉着的重要调节作用：皮肤光老化的影响

已有大量研究强调了人类角质形成细胞在皮肤色素沉着中所起的作用。例如，角质形成细胞通过释放大量的促色素沉着旁分泌生长因子，如αMSH、内皮素1（ET-1）、干细胞因子（SCF）和多种细胞因子，参与紫外线（UV）急性照射诱导的黑素合成（晒黑）。然而，越来越多的证据显示，真皮内成分在皮肤色素沉着调控中的作用不容忽视。20世纪90年代中期，证实细胞外基质（ECM）可调节黑素细胞的增殖、凋亡抑制和黑素生成活性。有报道证实，真皮成纤维细胞可通过分泌可溶性因子对色素沉着起调控作用。另外，对于构成性肤色，研究发现在掌跖，由成纤维细胞产生的Dikkopf-1（DKK-1）对黑素细胞的生长、活性以及对黑素小体转移均有抑制作用，且认为是这两处身体部位颜色较浅的原因。反之，深肤色皮肤内成纤维细胞分泌的神经调节蛋白1（NGR-1）的促色素沉着效应提示，该特定信号分子在决定高度色素沉着的皮肤类型中发挥作用。此外，在各种先天性色素沉着过度障碍中，如系统性硬皮病、皮肤纤维瘤、多发性神经纤维瘤的咖啡牛奶斑和泛发性进行性色素异常症，已知真皮黑素生成生长因子数量增加；这些因子包括SCF、肝细胞生长因子（HGF）或角质形成细胞生长因子（KGF）。表皮与细胞间质之间紧密的互动也可能在黑素细胞内稳态中发挥作用。最近已证实，层粘连蛋白332可通过调节L酪氨酸摄取来促进黑素生成。生长因子/细胞因子调节环也存在于真皮细胞和表皮细胞之间，并参与色素沉着的调控。

日光UV诱导人体外重建皮肤模型的生物学变化：UVA／UVB均衡光防护的重要性

皮肤是环境应激（尤其是日光照射）的主要靶器官。日光能导致皮肤的生物学和临床反应，包括，急性损伤（日晒伤和晒黑反应），以及慢性损伤（光老化、光致皮肤癌或色素沉着过度等）。在上述过程中，表皮和真皮均受影响。

含黑素细胞的人体外重建表皮模型评估芍药根提取物和芍药苷减少皮肤色素沉着的功效

芍药根是原产于亚洲中部和东部的一种草药，传统上认为具有美容功效。经去皮和煮沸处理后的芍药根在中国被称为“白芍”。在中国传统临床中医美容中，有大量关于口服白芍煎剂可使皮肤变白和缓减肤色异常（如棕色或黑色的色素斑点）的案例。最近，许多体内研究证实，口服白芍对皮肤具有抗过敏和抗皱的功效。芍药根提取物能够抑制小鼠皮肤的被动过敏反应和搔抓行为。另外有一项临床试验，对20例志愿者局部外用含0.5%芍药根提取物的化妆品制剂8周，结果显示，与安慰剂组相比，其面部皱纹具有显著改善。

体外研究真皮填充剂的一种新方法：用体外重建皮肤模型研究透明质酸增加成纤维细胞活性

面部老化的主要特征是皱纹、皱褶、弹性下降和皮肤松垂，反映皮肤深部出现了渐进性、持久性的改变。用填充材料增加软组织的含量以减少老化的临床表征，是一种普遍的抗皮肤老化策略，也是美容医学的一个扩展领域。

糖化作用刺激体外重建全层皮肤模型中单核细胞分化

晚期糖化终末产物（AGEs）是由蛋白质或脂质与糖（如葡萄糖和核糖）通过非酶糖化反应形成的，是公认与自然老化相关机制之一。皮肤生物学研究认为，糖化作用对与真皮基质分子影响皮肤老化的硬化有关，可能是由改变分子间交联所致；有研究在糖尿病和老化皮肤中检测到AGEs蓄积。有文献报道，AGE沉积可使皮肤生物化学特性和功能均发生变化。AGEs通过改变细胞外基质和细胞内蛋白质，可影响皮肤自稳态和皮肤常驻细胞的功能。

在体外重建皮肤模型上研究糖化反应对皮肤成分的影响

皮肤老化是内外因素重叠作用的结果,其中包括具有一定个体和遗传背景差异的内因性自然老化,以及受外部因素（紫外线、环境污染和生活方式）影响的外因性老化.在老化过程中,皮肤在形态学、生物化学以及功能学上均会发生相应的改变.皮肤发生老化现象的一个重要原因就是生命活动中晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products,AGEs）的产生.AGEs是由一种涉及糖和蛋白质糖化作用反应所产生的物质.该物质的产生会导致皮肤在物理学、生物机械学（硬度增加和弹性减退）以及生物学特性（合成代谢改变和基质退化）上发生一系列的变化.该文概述在人皮肤组织（特别是真皮成纤维细胞）和三维皮肤模型系统中观测到的AGEs的效应.

体外重建皮肤模型研究UVA1诱导皮肤损伤

皮肤是人体最大的器官,直接与外界环境接触,因此具有感知外部刺激、保护修复和维持身体内稳态等功能.紫外线（UV）作为外界环境因素之一,可诱导人皮肤急性或慢性的生物或临床损伤,如日晒伤、光免疫抑制、光老化和光致癌等.日光中UV由UVC（100～290 nm）、UVB（290～320 nm）和UVA（320 ～ 400 nm）组成,其中UVC全部被臭氧层阻挡,UVB和UVA能到达地表.已知UVA能够诱导活性氧簇（ROS）生成,导致皮肤的氧化应激反应.临床上UVA可导致皮肤色素沉着、光免疫抑制和光致癌.另外,由于UVA穿透能力强,可直达真皮层而导致真皮损伤,因此长期作用还可导致皮肤光老化.

体外重建皮肤模型（老化模型）中特定的晚期糖化终末产物诱导的生物学效应

人皮肤老化的特征包括弹性纤维减少、不溶性胶原蛋白蓄积以及创伤修复能力受损等。而对于皮肤曝光部位，促炎性改变还能导致富含胶原蛋白基质的重构，进一步加重上述变化。该基质重构过程可通过两种方式实现。第一种涉及晚期糖化终末产物（AGE）的产生（由葡萄糖和羰基醛经过化学反应生成），可导致细胞外基质发生蛋白质交联、固化及失去弹性等损害。第二种涉及富含AGE的真皮基质与真皮细胞之间的相互作用，通过AGE受体（RAGE）和其他受体途径引起细胞活化，导致生长因子和细胞因子的释放，从而使细胞外基质发生深度重构。

体外重建皮肤及单层培养角质形成细胞对模拟日光紫外线照射的分子应答

白种人的皮肤癌发病率已经高于过去的40年，主要原因是人们开始改变自己的生活习惯，外出度假而将自己过度暴露于日光下。现已确定，非黑素瘤皮肤癌发生的首要、而且是主要步骤为紫外线诱导的突变。UVB辐射（290-320nm）在诱导环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物中影响显著，这两种损害均具有高突变性。目前已有相关的人类基因突变的研究报道，特别是着色性干皮病，由于紫外线诱导DNA损伤的修复障碍而使该病患者发生皮肤癌的概率增加。