体细胞核移植克隆牛的遗传物质鉴定

应用活体取卵(OPU)技术采集遗传背景清晰的卵母细胞作为受体细胞,与不同来源的供体细胞核进行体细胞核移植(SCNT)。通过微卫星DNA及线粒体DNA检测,分别对5头克隆牛核内和核外DNA进行了分析。结果表明克隆牛的微卫星DNA与核供体牛完全一致,而线粒体DNA则全部来源于卵母细胞。

体细胞核移植技术在粤东黑猪遗传资源保护上的应用

实验旨在通过体细胞核移植技术(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)探究不同品种、性别、细胞代数对猪耳成纤维供体细胞建系效果与体外克隆胚胎效率的影响,为我国优良地方猪种或濒危猪种的遗传资源保护提供新的有效途径。本研究对比分析了粤东黑猪、小耳花猪2个广东省地方猪种以及不同性别的粤东黑猪供体细胞的细胞建系效果,并统计分析了粤东黑猪不同细胞代数制备克隆胚胎的体外发育效率。结果表明,粤东黑猪体细胞冻存可能受个体差异与供体月龄的影响,而体细胞核供体猪个体差异也会导致部分克隆胚胎的卵裂率存在显著差异,但对囊胚率无显著影响。同时本研究也证实,至少在3代(F1~F3)内,供体细胞的不同代数对粤东黑猪克隆胚胎体外发育效率无显著影响。本研究为优秀地方猪种的品种改良、保种提供了可行手段,为地方特色猪种的遗传资源保护奠定了技术基础。

体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究

[目的]探讨供体细胞类型、移植胚胎发育阶段、数量及部位对山羊转基因克隆效率的影响。[方法]利用体细胞核移植技术将转染人乳铁蛋白基因hLF的山羊胎儿成纤维细胞（GFF）和乳腺上皮细胞（GMGE）移植到MII期去核卵母细胞内，经电融合、激活、体外培养后，2-8细胞期克隆胚被移植到同期发情山羊的输卵管内，囊胚被移植到子宫角内。[结果]GFF与GMGE的妊娠率相近（输卵管移植妊娠率分别为26.47%及20.00%）；在GFF，输卵管移植的妊娠率与子宫角内移植妊娠率接近（分别为26.47%及25.00%），输卵管移植胚胎平均数为21.2组的妊娠率显著高于5.93组和9.64组（40.00%及26.67%，21.43%）。[结论]供体细胞类型、移植胚胎的发育阶段及移植部位对山羊转基因克隆效率的影响不大，但对于输卵管移植，受体羊移植胚胎数量对妊娠率有明显的影响。此外，该研究还提示了利用成年羊乳腺上皮细胞制作转基因动物的可行性。

牛体细胞克隆胚胎类ES细胞集落的筛选及其核移植

对第 7d的牛体细胞克隆囊胚进行体外增殖培养 ,分离筛选类ES细胞 ,并对其进行了传代培养。接种在饲养层上的体细胞克隆囊胚细胞 ,在传代的 2 4h内增殖形成小集落 ,2～ 3d有雀巢状的集落出现 ,筛选形态相同的细胞集落进行传代培养 ,4～ 5代后 ,皿底出现多个大小不等的多细胞单层集落。将传 4～ 5代的细胞集落接种到无饲养层的 4孔培养皿中培养 ,2 4h出现多细胞单层集落 ,4～ 7d长满皿底 ,并形成上皮样细胞 ,呈网状 ,将其作为核供体细胞进行核移植实验。结果有 80 % (40 5 0 )核 质融合的移核重构胚发生卵裂 ,5 % (2 4 0 )发育至桑椹胚期 ,2 5 % (1 4 0 )发育至囊胚期 ,92 5 % (37 4 0 )停止在 2～ 4细胞期。结果表明 :采用牛体细胞克隆胚胎的类ES细胞进行核移植 。

5头经玻璃化冷冻保存后移植的成年体细胞克隆牛降生

Batch production of bovine adult somatic cell cloned embryos by zona-free 2-half cytoplast manipulation technique resulted in the following rates(36 replicates): fusion 95 7% (3678/3842), cleavage 87 2% (3180/3645), blastocyst 42 2%(1540/3645), freezable embryos 31 4%(1145/3645), 30 days pregnancy after transfer of vitrified/thawed embryos 28 1% (48/171) Five live calves were born at term from 19th of July until 26th of October 2003 Four of the calves were delivered by cesarean section, and three died within 1 h and another at 5 days after delivery The only calf delivered naturally is still alive and

利用体细胞核移植技术生产黄牛和水牛同种、异种转基因克隆囊胚

以含neo和GFP基因双标记的水牛、黄牛胎儿成纤维细胞进行牛转基因体细胞核移植,结果发现:阿菲迪霉素可有效将胎儿成纤维细胞同步于G0/G1期;以GFP阳性细胞进行核移植,其卵裂率、囊胚率与对照组间无显著差异(P>0.05),所构建的重组胚,2-细胞阶段观察不到GFP的表达,4-细胞以后GFP的表达逐渐增强,在囊胚的内细胞团和滋养层细胞均可检测到GFP的表达,将黄牛同种转基因克隆囊胚进行移植,获得1例妊娠;黄牛卵母细胞一水牛供核细胞构建异种重组胚囊胚率显著高于黄牛供核细胞一水牛卵母细胞构建的异种重组胚(P<0.05),并且异种核移植重组胚中可检测到GFP表达,GFP可作为异种核移植胚胎来源的一种新标记.

表观遗传修饰影响哺乳动物体细胞核移植效率的研究进展

表观遗传修饰是一种不依赖于DNA序列变化的可逆、可遗传修饰,在哺乳动物胚胎发育的整个阶段均可发生,是影响哺乳动物体细胞核移植效率的主要因素之一。其中,DNA甲基化、组蛋白的动态修饰、X染色体失活、端粒与端粒酶活性变化作为常见的表观遗传修饰类型,任一修饰形式的异常都会影响基因的表达,引发体细胞重编程错误导致核移植效率降低。近年来,随着体细胞核移植技术研究的不断深入,表观遗传修饰影响体细胞核移植效率的关键作用机制日益明确。本文通过综述不同类型的表观遗传修饰影响哺乳动物体细胞核移植效率的研究进展,以期在表观遗传修饰层面为提高哺乳动物体细胞核移植效率提供新思路。

体细胞核移植的不完全核重编程与克隆动物的发育异常

体细胞核完全的重编程是成功生产克隆动物的先决条件,体细胞核的不完全重编程是克隆动物发育异常的主要原因。本文主要通过对DNA甲基化、组蛋白乙酰化、端粒、X染色体失活和印记基因表达几个方面的论述,来探讨造成克隆动物发育异常的原因。

体细胞克隆牛超排胚胎玻璃化冷冻及移植试验

对体细胞克隆牛进行了超数排卵、胚胎玻璃化冷冻及胚胎移植试验。首先对体外受精卵进行了玻璃化冷冻保存试验,结果表明,体外受精囊胚经过EPS10和EPS20的TCM-199液玻璃化冷冻-解冻后胚胎形态正常率和发育率各组间差异不显著,囊胚孵出率EPS20组为31.3%(35/112)极显著高于EPS10组的12.2%(13/107)(P<0.01),选择玻璃化冷冻液EPS20作为体细胞克隆牛超排采卵获得胚胎的冷冻保存液。本试验对体细胞克隆牛“康康”和“双双”进行了超排试验,分别获得6枚(4枚可用胚)和10枚(9枚可用胚)胚胎,各取2枚1级胚胎应用EPS20玻璃化液进行玻璃化冷冻,解冻后分别移植到4头同期发情处理的中国荷斯坦奶牛的黄体侧子宫角内,结果为1头9908号受体母牛妊娠,并且产下1头健康的体细胞克隆牛“双双”的胚胎移植后代。试验结果表明,①体细胞克隆牛与正常牛一样对外源激素(FSH)具有较好的应答能力和超数排卵的能力;②体细胞克隆牛的胚胎可用于玻璃化冷冻保存。

“动物体细胞核移植”教学中的疑点分析

在初高中生物学教材中,对于动物体细胞核移植过程中怎样对核供体细胞进行处理有不同的表述。本文对该技术的发展历史、实验方法以及具体实验操作步骤进行梳理、分析和总结,为师生提供参考。

不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响

系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40～44h的猪卵母细胞去核后，将经血清饥饿（0．5％FBS）培养2～9天、0．1mg／L Aphidicolin（APD）培养＋0．5％FBS培养2～9天或一般培养法（10％FBS）培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞，直接注射到去核的卵母细胞质中，或注射到卵周隙中，再经电融合（100V／mm，30μs，电脉冲1次）构建重构胚．重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6．DMAP激活处理，体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg／LAPD＋0．5％FBS培养处理后的重组胚卵裂率，均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞（P〈0．01）。卵丘细胞、颗粒细胞经0．1mg／LAPD＋0．5％FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞（P〈0．05）。以猪颗粒细胞为核供体时，电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法（P〈0．05），但囊胚发育率无显著差异（P〉0．05）。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞，其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异（P〉0．05）；以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时，各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异（P〉0．05）。这些结果表明：（1）猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定；（2）0．1mg／LAPD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果，血清饥饿培养则无明显效果；（3）猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞，核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚，但前者的效果略优于后者，且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响；（4）电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法，但两者的总体效率相近。

牛体细胞核移植技术

对牛体细胞核移植技术中核供体细胞周期同期化处理、电融合条件及去核方法等进行了研究。结果表明 ,血清 -饥饿组 (细胞周期同期化处理组 )的移核重构胚细胞融合率 (83.3% )、卵裂率 (70 % )和囊胚发育率 (33.8% )与血清 -选择组对应指标间无显著性差异 (82 .3%、6 9.2 %、32 .4 % ,P >0 .0 5 ) ;但上述 2组分别极显著高于血清 -随机组(6 4 .8%、33.8%、4 .35 % ,P <0 .0 1)。试验确立了场强 1.0 2 5 k V/cm、脉冲宽度 5 0μs、连续 2次电脉冲为最佳电融合条件。摸索出的点击去核法 ,对卵母细胞进行去核 ,去核成功率达 90 % ,极显著高于吸引法的 6 8.3% (P <0 .0 1) ;其囊胚发育率为 34.1% ,显著高于吸引法的 18.0 % (P <0 .0 5 ) ,与挤压法 (2 0 .9% )相比差异不显著 (P >0 .0 5 )。移核重构胚胎移植后 ,产

应用负压气相培养系统生产体细胞克隆牛的研究

以 - 35℃低温冷冻保存 3个月的Vari Fe 8mos和Fahru Fe 9mos死亡牛胎儿皮肤上皮细胞 ,为核供体细胞 ,应用点击去核方法 ,和 - 30 0mmHg、2 %CO2 、8%～ 10 %O2 、38.5℃和 10 0 %湿度负压气相培养系统 (负压组 ) ,进行了克隆牛试验研究 ,并与吸引和挤压及常压培养法进行了比较。结果表明 ,采用点击去核法对体外成熟培养18h、2 2h、2 4h的卵母细胞进行去核 ,去核成功率分别为 90 .0 %、75 .8%和 5 5 .6 %,18h组显著高于 2 2h组 (P <0 .0 5 ) ,极显著高于 2 4h组 (P <0 .0 1) ;而且 ,点击去核法去核率为 90 .0 %,极显著地高于吸引法的 6 8.3%(P <0 .0 1) ,与挤压法去核率 88.3%差异不显著 ;采用点击去核法囊胚发育率达 34 .1%,显著高于吸引法的 18.0 %(P <0 .0 5 ) ,与挤压法的 2 0 .9%差异不显著。负压组重构胚的卵裂率达 70 .0 %,显著高于常压组的 6 3.8%(P <0 .0 5 ) ,负压组囊胚发育率达 35 .8%,极显著高于常压组的 2 3.2 %(P <0 .0 1) ,负压组克隆囊胚细胞数为 10 8± 3.3个 ,极显著多于常压组的 98± 3.3(P <0 .0 1)。将第 6天的克隆桑椹胚和囊胚每 2～ 3枚装入 1支 0 .2 5ml塑料细管中 ,移植给同期发情处理的 5头受体奶牛的黄体侧子宫角中 ,最终获得 2头牛妊娠 ,并于 2 0 0 1年 11月 3日和 11月

牛供体细胞的来源、血清饥饿和预激活对核移植卵体外胚胎发育的影响

牛皮肤成纤维细胞经血清饥饿或预激活处理后获得核胞体 ,并注入去核卵母细胞内构建重组胚。检查重组胚 2 4h和 36h卵裂率以及 8d囊胚率 ,以评估供体细胞及其处理方法对体细胞核移植效果的影响。实验结果表明 :来自 3个年龄 (6、 18和 36月龄 )、 2个品系 (红安格斯肉牛和荷斯坦奶牛 )的 4头供体牛皮肤细胞重组胚的卵裂率和囊胚率均无差异。生长到完全汇合的 36月龄荷斯坦牛供体细胞血清饥饿 10～ 13d组重组胚的 36h卵裂率显著低于 0d (对照 )、 3～ 5d和 6～ 9d组 ,囊胚率显著低于 3～ 5d组 ;经 5 μmol/L离子霉素或7%乙醇预激活 5min重组胚的卵裂率和囊胚率均与对照组无差异。

猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养

目的本研究系统比较了体外受精胚(IVFEs)、孤雌激活胚(PAEs)以及体细胞核移植胚(NTEs)的发育率和囊胚质量,同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。方法利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs,开展体外培养。结果(1)IVFEs、PAEs和NTEs的卵裂率分别为72.0%,66.0%和63.5%,各组间没有显著差异(P>0.05);囊胚形成率分别为11.0%,22.6%和16.9%,也不存在明显不同(P>0.05);然而,在囊胚质量,即ICM细胞数/总细胞数的比例上,IVFEs和NTEs均优于PAEs(0.448%,0.356%vs 0.122%,P<0.05)。(2)对PAEs来讲,以PZM-3为基础培养基时囊胚率明显高于以NCSU-23为基础培养基时的处理组(35.4%vs.22.6%,P<0.05);而对NTEs而言,两种培养基在支持胚胎形成囊胚方面的效果相当(26.6%vs.21.1%,P>0.05),虽然PZM-3培养时胚胎卵裂率显著低于NCSU-23培养组(47.5%vs.63.5%,P<0.05)。结论(1)PAEs的囊胚质量在3种来源的胚胎中最差;(2)对PAEs理想的培养基,当用于NTEs培养时却不一定是最佳的选择。

不同融合条件对水牛体细胞核移植效果的影响

本研究主要探讨水牛体细胞核移植电融合的影响因素,以摸索出适合水牛体细胞核移植的电融合条件。结果显示:直流脉冲前施加2 .0 V交流电波能显著提高Φ<1 5 μm供体细胞的融合率及胚胎的卵裂率( P<0 .0 5 ) ,但对其存活率和囊胚率以及2 0 μm<Φ<3 0 μm供体细胞的融合率、胚胎的存活率、卵裂率及随后的囊胚发育率无显著影响( P>0 .0 5 ) ;然而无论施加交流电与否,直径2 0～3 0 μm供体细胞的囊胚率均显著高于直径小于1 5 μm供体细胞的囊胚率( P<0 .0 5 )。注核操作液中添加聚乙烯醇( PVA)对重组胚的融合率和卵裂率没有显著影响( P>0 .0 5 ) ,但激活后重组胚的存活率( 95 .83 %)及囊胚发育率( 1 1 .3 2 %)显著高于对照组的重组胚存活率( 74.77%)和囊胚率( 3 .75 %,P<0 .0 5 )。结果表明:( 1 )直流脉冲前施加2 .0 V交流电波能提高直径较小供体细胞的融合效果;( 2 )注核操作液中添加0 .1

TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达

不完全的表观遗传重编程是造成转基因克隆动物效率低下的主要原因,组蛋白修饰作为表观遗传修饰的一个重要部分,可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达情况。TSA(Trichostatin A)作为一种组蛋白去乙酰化抑制剂,可以改变组蛋白的乙酰化水平,促进表观遗传重编程,提高克隆动物的效率。同时TSA能改变染色质结构,使转录因子易于与DNA序列结合,促进外源基因的表达。文章确定了TSA处理转基因猪成纤维细胞和核移植胚胎的最佳条件,分别为250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h,通过进一步正交实验发现,TSA同时处理供体细胞和克隆胚胎可以显著的促进核移植胚胎的体外发育。此外,无论TSA处理转基因猪成纤维细胞或核移植胚胎,都可以提高外源基因的表达水平。

优化山羊体细胞核移植方案的研究

以乳腺细胞、胎儿成纤维细胞和颗粒细胞为供体细胞进行核移植,比较了供体细胞类型、细胞冷冻及核移植的重建方法(胞质内注射、电融合)对重构胚早期发育的影响。结果:(1)乳腺细胞支持重组胚的发育能力(囊胚率7.14%)显著低于成纤维细胞(16.19%)和颗粒细胞(19.01%)(P<0.05),卵裂率无显著差异(P>0.05);(2)乳腺上皮细胞构建重组胚时电融合法的效率(69.52%)极显著高于胞质注射法(59.20%)(P<0.01);成纤维细胞的重组成功率、卵裂率和囊胚率在两种方法间均无显著差异(P>0.05);在颗粒细胞,胞质注射法重组成功率(82.17%)显著高于电融合法(50.99%)(P<0.05),其囊胚率也稍高于电融合法,但无显著差异(P>0.05);(3)上述3种供体细胞在冻融后支持重组胚发育力方面无显著差异(P>0.05)。结论:在山羊体细胞核移植中,上述3种细胞支持重组胚的发育力以成纤维细胞和颗粒细胞较好;细胞冷冻对其无显著影响;在构建重组胚方法上,乳腺细胞以电融合法为宜,颗粒细胞是胞质注射法优于电融合法,而成纤维细胞两种方法均可。

受体卵母细胞来源和供体细胞类型对山羊体细胞核移植融合率的影响

以波尔山羊体细胞作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同供体细胞类型对核移植重构胚融合率的影响。结果:以体内成熟和FSH处理卵巢、屠宰场卵巢来源的体外成熟卵母细胞做核移植受体卵母细胞,重组卵的融合率分别为71.9%,78.4%,73.1%,三者之间差异不显著;以卵丘细胞和皮肤成纤维细胞做核供体,重组卵的融合率分别为77.1%,68.3%,二者之间差异显著。

供体细胞和去核卵母细胞的不同预激活对体细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究用细胞质内注射法构建重组胚,比较了离子霉素和乙醇预激活供体细胞和去核卵母细胞对重组胚卵裂和体外发育的影响。结果表明:与未经处理的对照组相比,离子霉素预激活供体细胞时重组胚的卵裂率和囊胚发育率有所提高;而供体细胞和去核卵母细胞同时用离子霉素预激活,重组胚的卵裂率无明显提高,囊胚发育率下降;用离子霉素或乙醇预激活去核卵母细胞,对重组胚的卵裂和发育无明显影响。