珙桐体细胞胚胎发生技术研究

研究探讨基本培养基类型对珙桐愈伤组织诱导的影响、植物生长调节剂对胚性愈伤组织诱导及体胚发育的影响,初步建立以未成熟合子胚为外植体,通过体细胞胚胎发生途径再生珙桐植株的培养方案。结果表明,在含有3%蔗糖、0.3%凝胶、800 mg/L水解酪蛋白、400 mg/L L-谷氨酰胺的MS、1/2MS和WPM基本培养基上均可诱导出愈伤组织,以MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA诱导率最高,可达94.0%;胚性愈伤组织在MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的培养基上诱导效果较好;在MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA培养基上,体胚诱导率可达22.9%;成熟体胚在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IBA的萌发培养基上能正常萌发,其后在添加1 g/L活性炭的萌发培养基上转化成完整小植株。组织细胞学观察表明,珙桐体胚起源于胚性愈伤组织,经历了球形期、心形期、鱼雷期和子叶期发育阶段,这与自然条件下的合子胚形成过程相似。

CsAHL25通过影响CsHB1、LEC1/B3基因表达调控柑橘体细胞胚发生

【目的】基于柑橘体细胞胚发生相关基因CsHB1的启动子筛选其上游转录因子,以期为柑橘体细胞胚发生分子机制研究提供可靠的候选基因。【方法】利用CsHB1启动子(-1018~-558 bp)进行酵母单杂筛库实验,筛选出CsHB1上游转录因子CsAHL25;利用亚细胞定位实验,确定CsAHL25在细胞中的位置;通过酵母单杂点对点、双荧光素酶实验验证CsAHL25对CsHB1表达的影响;利用qRT-PCR探究CsAHL25基因在柑橘体细胞胚诱导过程中的表达模式;在柑橘愈伤组织中瞬时表达该基因,并检测体细胞胚发生相关基因的表达变化。【结果】CsAHL25在柑橘体细胞胚诱导过程中呈现先上升后下降的表达模式,该蛋白定位在细胞核中,能与CsHB1启动子结合并下调CsHB1的表达。瞬时表达CsAHL25会导致CsHB1表达量下调,及CsABI3、CsFUS3、CsLEC1、CsL1L等促进体细胞发生的LEC1/B3基因表达量上调。【结论】CsAHL25能直接下调CsHB1的表达,并使LEC1/B3基因表达量上升。CsAHL25可能通过调整CsHB1、LEC1/B3基因的表达促进体细胞胚发生。

马瑟兰葡萄体细胞胚再生体系的建立

[目的]建立欧亚种葡萄马瑟兰体细胞胚再生体系,为其遗传转化体系的建立奠定基础。[方法]以马瑟兰的花蕾和未成熟种子为外植体,研究2,4-二氯苯氧乙酸、褪黑素、6-苄氨基嘌呤和噻苯隆激素不同组合(Fow1~6和Ims1~6)对其体细胞胚的诱导作用。[结果]马瑟兰花蕾在Fow6培养基上以及未成熟种子在Ims2和Ims5培养基上愈伤诱导率最高,可达67.19%~78.00%;将其培养12~14周后的愈伤组织转移到EM6培养基上持续培养,花蕾愈伤组织未能得到体细胞胚,而来源于Ims3培养基的未成熟种子愈伤组织具有较高的体细胞胚发生率(6.77%),并可在EM6培养基上正常成苗;SCM6培养基有利于愈伤组织悬浮培养,可获得大量增殖良好的非胚性细胞团,细胞学观察结果表明愈伤细胞状态良好。[结论]以马瑟兰未成熟种子为外植体,首次建立了其体细胞胚再生体系和愈伤组织悬浮培养体系,对其遗传转化体系的建立、品质相关基因功能验证和分子育种等研究具有良好的支撑作用。

大豆成熟种子萌发叶片体细胞胚的高频诱导和遗传转化

目的虽然大豆遗传转化取得了较大进展,但其转化效率仍然偏低。因此,有必要建立一个更加简单和高效的大豆转化系统。本研究的目的是以大豆成熟种子萌发产生的叶片(MSDL)为靶外植体,高频诱导和转化大豆体细胞胚(somatic embryos,SEs)。方法萌发7 d的大豆幼苗上摘取叶片,并将其切成1.2 cm×1.2 cm的外植体。将叶片外植体置于胚胎诱导培养基(EIM)上诱导体细胞胚发生。将叶片外植体浸入携带p CAMBIA1301植物表达载体的农杆菌EHA105菌液进行遗传转化。结果MSDL(包括初生叶和次生叶)均能被诱导产生SEs。大多数SE发生在叶片切口处。所试的不同基因型均能诱导SEs。SEs的最高诱导率为95.0%。β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色结果表明,平均转化效率达到75.4%。DNA印迹(Southern blot)结果表明,目的基因稳定整合在大豆基因组中,拷贝数为1~3个。结论本研究建立了以大豆MSDL为靶组织的体细胞胚高频诱导和遗传转化。该系统有望在大豆基因组编辑技术的开发上得到应用。

大蒜体细胞胚发生及不同发育阶段的形态解剖学特征

为了诱导大蒜外植体形成体细胞胚、明确大蒜体细胞胚发生过程及不同阶段的形态解剖学特征,以大蒜品种‘二水早’为材料,探讨不同外植体和植物生长调节剂对大蒜胚性愈伤组织诱导和体细胞胚成熟萌发的影响,观察大蒜体细胞胚发生过程中形态、组织和超微结构变化。结果表明:大蒜花序轴、鳞茎盘和发芽叶基胚性愈伤组织诱导最适宜的2,4-D质量浓度分别为3.0、2.0、2.0和3.0 mg/L,诱导率分别为82.22%、89.21%、82.52%和83.40%。在2,4-D 0.25 mg/L+6-BA 0.5 mg/L条件下,体细胞胚的萌发系数最高,达35.56个/g。以花序轴为外植体,依据形态和组织学特征,可将体细胞胚发生早期过程划分为外植体、愈伤组织、初期胚性愈伤组织、后期胚性愈伤组织和球形胚5个阶段:外植体-花序轴顶端形成一层半透明的物质,表面不光滑,为愈伤组织,组成愈伤组织的细胞为典型的薄壁细胞。在愈伤组织局部形成明显的表面光滑的颗粒状突起,为初期胚性愈伤组织,解剖学观察发现薄壁细胞中产生了胚性细胞团。当颗粒状突起几乎完全覆盖外植体,表明形成大量胚性愈伤组织,为后期胚性愈伤组织,其由大量胚性细胞组成。球形胚为表面光滑、半透明的球状组织,组成球形胚的细胞呈分生细胞状态。由大蒜体细胞胚萌发形成的植株,培养90 d后可形成试管鳞茎,将其播种在由草炭、珍珠岩、蛭石按2∶1∶1体积比配制的复合基质中,试管鳞茎的出芽率为70.73%,试管鳞茎苗的成活率达96.55%。

百蕊草体细胞胚的分化及其内源生长调节物质的变化特性

【目的】探明百蕊草体细胞胚发生过程中的组织细胞特征及内源生长调节物质的变化规律,为建立百蕊草体细胞胚组培苗快繁技术体系提供理论参考,并为丰富百蕊草细胞分化和器官形态建成等基础理论提供基础信息。【方法】采用显微观察方法对叶片外植体诱导的百蕊草愈伤组织及不同分化培养时期的体细胞胚进行组织细胞学观察,并检测不同分化时期的体细胞胚内源激素和类似物含量、抗氧化酶活性及可溶性蛋白质含量。【结果】胚性和非胚性愈伤组织的形态和细胞结构差异明显。体细胞胚分化经历的时期有多细胞原胚(PM)、球形胚(GE)、心形胚(HE)、鱼雷形胚(TE)和子叶胚(CE)等。内源激素及类似物中反式玉米素(tZT)含量与玉米素核苷(ZR)和吲哚-3-乙酸(IAA)含量呈显著正相关(r=0.421^(*),r=0.536^(*)),与脱落酸(ABA)含量呈极显著负相关(r=-0.688^(**)),tZT与IAA、ZR对百蕊草体细胞胚发生的作用相同。ABA含量与IAA和ZR含量呈显著负相关(r=-0.401^(*),r=-0.430^(*))。赤霉素3(GA_(3))含量与IAA含量呈弱正相关性(r=0.313),作用类似,均可促进细胞和器官的伸长。水杨酸(SA)含量变化呈波浪形变化,且最高值4.56 ng/g和最低值3.29 ng/g分别出现在PM和GE时期,说明与体细胞胚发生有关。抗氧化酶中过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性持续升高,并且保持在较高水平,尤其是在胚分化后期。超氧化物歧化酶(SOD)活性从PM至GE时期迅速上升并于GE出现峰值29.19 U/(g·min)之后下降,但其活性较POD和CAT低。可溶性蛋白(SP)含量由PM至GE时期稍有下降,于HE时期升高达最大值2.24 ng/g,之后缓慢降低。SP含量呈波动性变化。【结论】百蕊草体细胞胚的发育过程与合子胚的发育过程相似,并且内源激素及类似物异戊烯腺嘌呤(IP)、tZT、ZR、IAA、GA 3、ABA、SA及抗氧化酶(POD、CAT、SOD)和SP具有不同程度的影响和调控作用。

松杉类植物体细胞胚发育机理的研究进展

植物体细胞胚胎发生不仅可作为其繁育的重要手段,而且也是研究胚胎发育过程的一种重要模式系统.体细胞胚在形态和生理上的成熟,直接影响到植株的萌发和再生频率.本文综述了近年来国内外有关裸子植物中几种松杉类植物体细胞胚发育过程的研究报道,其中主要涉及培养基成分和脱落酸(ABA)对体细胞胚发育的影响,以及体细胞胚发育在细胞学、细胞程序性死亡、相关基因和蛋白质组学等方面的研究进展,并进一步讨论了松杉类植物体细胞胚的发育机理,以及体细胞胚在遗传转化系统中的作用.

云杉未成熟合子胚诱导体细胞胚胎发生

以云杉未成熟合子胚为外植体,研究球果采集日期、基因型、植物生长素和细胞分裂素对愈伤组织诱导的影响,同时对影响体细胞胚分化和成熟的关键因素进行探讨。结果表明:合适的胚性愈伤组织诱导和增殖培养基为1/2 LM+2,4-D 2.2 mg·L-1+6-BA 1.1 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+凝胶2 g·L-1+酶解酪蛋白1 g·L-1;合适的分化培养基为1/2 LM+ABA 24 mg·L-1+PEG4000 50 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+活性炭1 g·L-1+凝胶4 g·L-1+水解酪蛋白1 g·L-1;合适的萌发培养基为1/4 LM+蔗糖20 g·L-1+活性炭1 g·L-1+凝胶4 g·L-1+水解酪蛋白1 g·L-1。以上培养基中均附加谷氨酰胺0.5 g·L-1,pH5.8。

大蕉(Musaparadisiaca ABB Linn.)花序愈伤组织的诱导及其体细胞胚发生

大蕉未成熟雄花接种到胚性愈伤组织诱导培养基中,4￣5个月后可诱导出胚性愈伤组织,并可在继代培养基上增殖。胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基中可诱导出体细胞胚。体细胞胚在成熟培养基上培养2个月后转移到含有0.2mg·L-16-BA的分化培养基上可以萌发,进而形成再生植株。组织学切片证明所诱导的愈伤组织是胚性组织,其所产生的体胚具有典型的单子叶植物体细胞胚的组织结构。

棉花体细胞胚发生机理的研究进展

棉花是一种较难通过体细胞胚发生完成植株再生的作物,而体细胞胚发生是限制棉花基因工程和细胞工程得以广泛应用的主要因素.研究者从不同角度探讨了棉花体细胞胚发生机理并取得了很大的进展,为棉花的遗传转化提供了重要的技术支持,同时成功建立了一些棉花植株再生体系.本文分别从基因型限制、胚胎学、生理生化变化、分子机理等方面阐述了近年来棉花体细胞发生机制的研究进展,并讨论了本研究领域目前存在的主要问题及相应对策.

甘薯体细胞胚状体及其在脱毒、扩繁中的应用

通过甘薯徐薯 18茎尖体细胞培养诱导胚性愈伤组织和胚状体 ,建立了体细胞无性系。胚性愈伤和胚状体诱导培养基为 MS附加 0 .5～ 2 .0 m g/ L 2 ,4 - D、0 .5 mg/ L NAA、0 .1mg/ L BA及 10 0 mg/ L HL。研究结果表明 :采用茎尖体细胞胚胎发生途径能够同时实现试管苗的深度脱毒及大幅度提高扩繁量 ,脱病毒率达 95 % ,扩繁量达 382 .9倍。田间种植该脱病毒种苗能使甘薯产量比茎尖培养试管苗提高 5 0 %～ 10 0 %。

温度和水分对不同基因型小麦未成熟胚体细胞胚胎发生以及分化能力的影响

对小麦未成熟胚盾片组织离体再生途径中 ,未成熟胚发育时期以及不同小麦品种的体细胞胚发生能力和体细胞胚的分化能力进行了研究。在所试的 1 4个小麦品种中 ,筛选出具有很强的体细胞胚发生能力和体细胞胚分化能力的 4个品种 :西农 1 376、盐 2号、85+1 - 3和宝丰 72 2 8。为进一步给小麦离体遗传操作打下基础 ,研究还对温度的影响进行了分析 ,通过低温手段解决了胚性愈伤组织随继代天数的延长体细胞胚分化能力快速降低的问题。同时研究还首次分析了干燥处理对小麦体细胞胚转换能力的影响 ,建立起一套高效的小麦离体培养再生体系 ,而且该体系从接种未成熟胚到再生植株移至土壤只需 1 0～ 1 2周时间 。

ABA对植物体细胞胚胎发育影响的研究进展

该文综述了ABA对植物体细胞胚胎发生发育的促进和抑制作用及对体细胞胚的几种内含物产生的影响 ,同时介绍了体细胞胚胎中ABA应答基因的表达及克隆研究进展 .

花生体细胞胚胎发生的组织细胞学研究

成熟花生胚轴在 MS+40 mg/L 2 ,4D+0 .5 mg/L KT培养基中可直接诱导产生体细胞胚 ,降低 2 ,4D的浓度 ,将诱导产生的体细胞胚组织块继代 2～ 3次可诱导产生出米黄色颗粒状的胚性愈伤组织 ,继而产生体细胞胚。花生体细胞胚直接诱导起源于表皮或近表皮的细胞 ,其形成经历了跟合子胚相似的过程。花生胚性愈伤组织的细胞具有细胞小、胞质浓、核大、核仁明显 ,排列紧密的特点。经愈伤组织形成的体细胞胚以单细胞内起源方式发生。首先由体细胞胚单个原始细胞分裂形成 2细胞原胚 ,2细胞原胚继续分裂成 3细胞原胚或 4细胞原胚 ,3细胞原胚或 4细胞原胚继续分裂形成多细胞原胚 。

植物体细胞胚发生过程中基因表达的研究进展

植物体细胞胚胎发生是一个复杂的发育过程,研究者们通过分析植物体细胞胚发生过程中的基因表达或胚性组织和非胚性组织中基因的差异表达,获得了在体细胞胚发生过程不同时期表达的基因,并分析了这些基因在胚胎发生途径中可能的作用。综述了在植物体细胞胚发生过程中细胞周期相关基因、胁迫和激素应答相关基因、信号转导相关基因、晚期胚胎丰富蛋白基因及与体细胞胚发生相关的胞外蛋白基因表达的研究进展。

渗透剂对白刺花体细胞胚成熟及萌发的影响

该研究以蔗糖、麦芽糖、山梨醇及PEG(6000)为渗透剂,探讨了不同渗透剂对白刺花体细胞胚发育、胚成熟及萌发的影响。结果表明:白刺花下胚轴形成的胚性愈伤组织接种至MS+2,4-D 0.2 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1+6-BA 2.0 mg·L^-1+TDZ 1.0 mg·L^-1+蔗糖40 g·L-1+谷氨酰胺100 mg·L^-1+植物凝胶3 g·L-1的培养基上,体细胞胚发生率高达66.21%,总胚数为79个;7%蔗糖可使体细胞胚成熟率高达64.36%,同时也可提高多子叶畸形胚形成;2%麦芽糖+2%山梨醇+4%蔗糖组合使体细胞胚成熟率最高达88.89%,畸形胚比例最低;30 g·L-1 PEG培养时,体细胞成熟率最高,为82.35%;鱼雷期的体细胞胚最合适转接,可使体胚萌发率达90.58%,复合糖上培养得到的成熟体细胞胚生根率最高,为87.47%。这为实现白刺花体细胞胚育苗奠定了理论基础,并提供了可行的方案。

苜蓿体细胞胚发生与成苗研究 Ⅲ.脱落酸处理提高体细胞胚的质量

在液体培养基中诱导产生的苜蓿体细胞胚,诱导第12天时生活力较高。超过12天后,体细胞胚由绿色向褐色转变,体细胞胚肥大肿胀,最后死亡。若将誘导12天产生的体细胞胚转移到成分相同的固体培养基上继续培养,则体胚进一步发育和转化成小苗。在固体培养基中加入脱落酸(ABA),可以抑制体细胞胚萌发,促进体细胞胚健康度提高,获得高质量的成熟休细胞胚。在固体培养基诱导产生的体细胞胚健康度比液体培养基中誘导的高得多。

北美枫香雄花和花序轴诱导体细胞胚胎发生

北美枫香是适应性强、生长速度快、秋叶红艳美丽的园林绿化树种。为了提高其繁殖效率,以北美枫香雄花和花序轴为外植体,采用完全随机区组设计,研究外植体类型,基因型,TDZ浓度对北美枫香愈伤组织的诱导、体胚分化和萌发的影响。结果表明:雄花作为外植体,合适的诱导培养基为改良Blaydes培养基+TDZ 0.15 mg/L+水解酪蛋白1 g/L+蔗糖40 g/L+3%植物凝胶;花序轴作为外植体,合适的诱导培养基为改良Blaydes培养基+TDZ0.01 mg/L+水解酪蛋白1 g/L+蔗糖40 g/L+3%植物凝胶。合适的萌发培养基为不含水解酪蛋白的基本培养基。如果出现球形胚,将培养物转接到不含任何生长调节剂的改良Blaydes培养基上,体胚经成熟可进一步形成完整小植株。该体胚体系的建成将显著提高北美枫香的繁殖效率。

不同红蓝配比的光质对棉花体细胞胚胎发生和植株再生的影响

【目的】设置不同的光质组合,明确不同光质对棉花体细胞胚胎发生的影响,为提高棉花体细胞胚胎发生能力和加快棉花转基因过程提供依据。【方法】分别设置不同红蓝配比的光质组合B﹕R(蓝﹕红)=1﹕1、B﹕R(蓝﹕红)=3﹕1、B﹕R(蓝﹕红)=1﹕3和DL(日光灯),将CCRI12(中棉所12)棉花下胚轴切段依次在愈伤诱导培养基上(callus induction medium,CIM)、胚性愈伤组织诱导培养基上(embryogenic callus differentiation medium,ECDM)、体细胞胚诱导培养基上(embryoid induction medium,EIM)和再生植株诱导培养基(regenerated-plantlet induced medium,RIM)上培养。统计在4种不同光质配比下,体细胞胚胎发生各个阶段对应的指标,包括愈伤增殖率(callus proliferation rate,CPR)、愈伤增殖量、胚性愈伤分化率、体细胞胚数量、生根率、下胚轴数量、再生棉花植株数量、叶绿素浓度等。【结果】与B﹕R=1﹕3和DL光质组合相比,B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1的光质组合均显著促进了愈伤的增殖率,但抑制体细胞胚长出下胚轴;与B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1相比,B﹕R=1﹕3和DL光质组合均促进胚性愈伤分化和诱导体细胞胚的产生,在诱导下胚轴生根方面,B﹕R=1﹕1组合生根率明显高于其他3种处理;B﹕R=1﹕3和B﹕R=1﹕1处理后下胚轴成苗数、植株高度和叶绿素浓度明显高于B﹕R=3﹕1和DL光质组合,B﹕R=1﹕3的促进效果最明显。【结论】明确了不同光质组合在体细胞胚胎发生各个阶段的调控作用,在体细胞胚胎发生各个阶段可以选择性地应用最优的光质组合。其中红蓝配比为B﹕R=1﹕3的光质组合在整体上能促进棉花体细胞胚胎的发生。

地被菊花Fall Color体细胞胚途径再生、遗传转化及转基因植株的抗寒性检测

【目的】培育耐寒性强的地被菊花[Dendranthemagrandiflorum(Ramat.)Kitamura]新材料。【方法】以FallColor品种的幼嫩叶片为外植体,探讨胚状体诱导所需的植物生长调节剂浓度和诱导培养时间等条件。【结果】叶片外植体在添加0.75mg·L-12,4-D的诱导培养基上诱导15d,再进行分生培养,不仅能够诱导胚性愈伤组织形成,还能够诱导胚状体发生,并进一步诱导芽再生,最终93%的供试外植体通过胚状体途径获得芽的再生。通过根癌农杆菌介导法将35S启动子驱动的逆境诱导转录因子DREB1A基因导入该品种。转化株在低温下的种子发芽率、扦插苗生长以及植株露地越冬生长状况等方面都明显优于对照。【结论】本研究成功地建立了地被菊花FallColor体细胞胚再生途径,并成功地获得了具有越冬耐性的地被菊花转化株系。