供体核和受体胞质在核移植重构胚重编程中的研究进展

供体核和受体胞质是影响核移植重构胚重编程的主要因素。文章讨论了供体细胞中的成熟促进因子、形态、核仁结构、组蛋白变化及其DNA甲基化和受体胞质在核移植重构胚重编程中的作用,并且综述了几种促进核移植重编程的方法。

核移植前激活牛受体卵子对供体核形态变化的影响

研究以牛体外受精卵作为供体、体外成熟卵子作为受体进行核移植。核移植后根据受体卵子的激活与否及细胞融合时间不同,分别观察了供体核在受体卵子内变化。

改性壳聚糖亲核一氧化氮供体的合成及释放性能

分别用二乙烯三胺、丙醛对壳聚糖的氨基进行改性,并与NO气体在甲醇钠/甲醇溶液中6×101.3kPa反应7 d,得到两种改性壳聚糖/一氧化氮加成产物。采用FT-IR、UV1、H-NMR和13C-NMR对产物的化学结构进行了表征,并用Griess试剂法测定了其NO释放曲线。NO释放试验表明,增加改性壳聚糖亲核位点NH的数量可以显著提高NO负载量。CS/DETA/NO的NO最大释放量为1945 nmol/mg,CS/PA/NO的NO最大释放量是1156 nmol/mg。

赖氨酸改性壳聚糖亲核NO供体的合成

首先对壳聚糖进行羧甲基化,通过N,N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将赖氨酸连接到壳聚糖的C6位点,与NO气体在甲醇钠/甲醇溶液中607.9kPa反应7d,合成了一种具有良好生物相容性的含有[N(O)NO]-官能团的亲核NO供体。采用红外光谱(FT-IR)、紫外(UV)和核磁共振(1H-NMR)对产物的化学结构进行了表征,并用Griess试剂法测定了其NO释放性能。释放曲线显示,赖氨酸改性壳聚糖亲核NO供体的NO释放总量为327nmol/mg,释放半衰期为t1/2=0.23h。

牛核供体胚发育阶段对核移植卵发育率的影响试验

本试验以体外培养６８、９２、１１６、１４０小时的体外受精卵为核供体胚，以体外培养成熟的卵母细胞为核受体进行了核移植试验。结果获得了８２％—９６％的融合率：将融合后的核移植卵与牛输卵管上皮细胞共同培养，７３％—８７％发育至２细胞期胚；２２％—５３％的核移植卵发育至８细胞期胚；以１１６小时组发育率最高，１４０小时组发育率最低；核移植卵发育至囊胚的比率分别为１３％（１３／１０２）、３％（２／７１）、３５％（３３／９５）和１２％（１２／９９），以９２小时组最低，１１６小时组最高。试验结果表明，核供体胚发育阶段及细胞周期对核移植卵的发育率有显著影响。

我国首例成体体细胞作为核供体的东北民猪克隆成功

10月12日，在哈尔滨市三元畜产实业有限公司种猪场，由东北农业大学刘忠华博士带领的《东北民猪体细胞核移植研究》课题组与哈尔滨市三元畜产实业有限公司合作，培育出的我国首例采用成体体细胞作为核供体的3头健康雌性克隆东北民猪以剖腹产的方式顺利出生．克隆猪各项形态特征与供核体细胞个体完全一致。

小鼠体细胞核移植及ES细胞样集落分离

利用小鼠皮肤成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植并从重构胚中分离胚胎干细胞(ES)样 集落,以便对体细胞核移植重构胚来源的ES细胞样集落进行研究.结果显示,小鼠皮肤成纤维细胞 作为核供体,核移植重构胚激活率为60.48％(254/420),囊胚发育率为6.90％(29/420),6个囊胚中 分离出ES细胞样集落,分离率为1.43％(6/420),3个ES细胞样集落能够稳定传代,至第5代时核 型正常率分别为77.84％,75.18％,77.20％.分离出的ES细胞样集落具有岛屿状团状隆起结构, 碱性磷酸酶染色呈阳性,体外可自发分化成上皮样或梭形细胞.实验证实小鼠唇部皮肤成纤维细胞能 够支持体细胞核移植重构胚发育至囊胚,并能分离出可以稳定传代的ES细胞样集落.

体细胞核移植技术在不同物种中的应用及提高其成功率的可能措施

体细胞核移植技术具有极其广阔的应用前景,但极低的成功率限制了这项技术在实践生产中的应用。不同的学者在不同的物种上进行了一系列的尝试,试图提高体细胞核移植的成功率。就体细胞核移植技术在不同物种中的成功应用进行阐述,并就如何提高体细胞核移植成功率阐明一些观点。

小鼠皮肤成纤维细胞的体细胞核移植

取成年小鼠唇部皮肤进行培养, 分离成纤维细胞并血清饥饿培养1 周, 用作核供体。对成年小鼠进行超排, 取卵母细胞用作核受体,核移植重构胚经SrCl2 激活处理6 h后, 同mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞共培养, 把发育到早期囊胚的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上, 添加ES细胞条件培养液,消化分离ICM,然后接种培养, 对孵出的ES细胞样集落进行鉴定培养。结果显示, 小鼠唇部皮肤成纤维细胞为核供体, 核移植重构胚2 细胞率为54 05%, 桑椹胚率17 14%, 囊胚率6 90 %, 对照组卵丘细胞的核移植重构胚2 细胞率为60 00%, 桑椹胚率21 85%, 囊胚率11 69 %, 但2种供体细胞在支持核移植重构胚发育能力上差异不显著。成纤维细胞重构囊胚中6个囊胚分离出ES细胞样集落, 3个ES细胞样集落可稳定传代; 对照组卵丘细胞重构囊胚中9个囊胚中分离出ES细胞样集落, 5个ES细胞样集落可稳定传代。从核移植重构胚中分离出的ES细胞样集落具有岛状或巢状群体生长形态,生长旺盛的集落可自发分化成单个散在或片状存在的上皮样或梭形细胞, 碱性磷酸酶检测为阳性, 常规冻存复苏, 仍显示ES细胞特征。

哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题

哺乳动物体细胞克隆技术的成功是生物高新技术的重大突破,具有划时代里程碑的作用.在分析哺乳动物体细胞克隆技术的基本环节及其研究现状的基础上,对其产生的意义和存在的问题作了综合评述,并对其发展前景作了展望。

哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

哺乳动物体细胞克隆技术在动物育种及珍稀动物保护领域具有极其广阔的应用前景,但极低的成功率限制了这项技术的应用。相关学者从不同方面进行了研究,试图提高体细胞克隆技术的成功率。综述了近年来哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展,为其相关研究提供必要的参考。

猕猴核移植研究进展及前景(待续)

本文回顾了猕猴核移植相关简史 ,介绍了猕猴核移植的技术路线 ,对限制猕猴体细胞核移植研究的因素 :核供体的筛选、卵母细胞的获得、超数排卵的影响因素、重构胚的激活及体外培养体系等进行了综述 。

小鼠第一极体基因组移植的时间窗探索

目的以杂交一代(BDF1)小鼠为模型,探索小鼠第一极体基因组移植(PB1T)的最佳时间窗,提高第一极体基因组移植重构胚存活率和体外发育能力,为临床研究和应用提供前期动物实验基础。方法获取注射人绒毛膜促性腺激素(h CG)后12.5、13.5、14.5、15.5 h 4个时间点的MII卵子作为实验组。分别取第一极体作为核供体,取h CG后14h的MII卵子,去除纺锤体染色体复合物后作为胞质供体,构建四组第一极体基因组移植重构胚。获取MII卵子进行体外受精并培养作为对照组(IVF组)。体外培养并观察实验组4组重构胚以及对照组卵子存活情况、体外受精、卵裂和囊胚发育情况。结果在4组实验组中,13.5 h组的PB1T重构卵子的存活率、体外受精率、2-细胞形成率、4-细胞形成率和囊胚率均最高,与IVF对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。14.5 h组的重构卵子的存活率、体外受精率和后续发育率稍低于13.5 h组,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。15.5 h组的重构胚体外受精率和囊胚形成率均最低(76%、41.7%),与对照组相比差异有统计学意义(P=0.020 0,P=0.005 7)。结论 BDF1小鼠h CG后13.5 h和14.5 h的卵子的第一极体基因组在新的供体胞质中能够更好地重建发育潜能,行PB1T可能的最佳时间窗为h CG后13.5~14.5 h。

以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎

利用所构建的含新霉素抗性(Neo^r)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双标记选择载体,通过电穿孔的方法,分别转染了牛胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、胎儿卵巢上皮细胞、颗粒细胞,经过800μg/mL的 G418筛选14 d后,均获得了阳性细胞株.分别以未转基因牛颗粒细胞和4种细胞系的转基因细胞为核供体,进行了牛的体细胞核移植.结果表明:(i)转基因与未转基因牛颗粒细胞的重组胚的囊胚发育率(44.6％vs 42.8％)、移植妊娠率(19％ vs 25％)差异不显著(P>0.05);(ii)比较4种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿输卵管上皮细胞(49.1％)和颗粒细胞(44.6％)最高,牛胎儿成纤维细胞(37.2％)次之,胎儿卵巢上皮细胞的重组胚囊胚发育率(22.5％)最低,三者之间差异显著(P<0.05).以上结果显示,供体细胞的转基因与否对牛克隆胚胎的体外和体内早期发育影响不明显;通过体细胞核移植技术,牛胎儿输卵管上皮细胞和颗粒细胞可以有效地生产牛转基因囊胚,并且绿色荧光蛋白作为一种无毒性作用的筛选标记,可用于转基因胚胎的筛选.

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。

体细胞克隆中核的重编程

尽管体细胞克隆在绵羊、牛、小鼠、猪、山羊、兔、猫、大鼠和骡子等物种中都获得了成功,但却未能得到狗和猕猴的克隆个体,而且克隆效率非常低.克隆效率低使体细胞克隆技术在科研和生物技术等方面的应用受到限制.供体核移入去核的卵细胞后,必须经过表观遗传修饰的重编程,回到胚胎开始发育的全能状态.目前认为:供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因.本文从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、端粒、印记基因以及其他发育相关基因的表达几个方面来探讨影响克隆效率的因素.

哺乳动物克隆的原理与途径

在近年来哺乳动物克隆技术研究的基础上；阐述了克隆的定义及其原理。叙述了作为核供体与受体细胞周期的协调性问题，列出了使供体细胞处于特定细胞周期的一些处理方法。同时也叙述了针对不同时期的供体核对受体卵母细胞采取的不同处理。简述了不同类型的显微操作、去核、电融合及化学激活等方法。提出了哺乳动物克隆所面临的一些重要问题。