牛供体细胞的来源、血清饥饿和预激活对核移植卵体外胚胎发育的影响

牛皮肤成纤维细胞经血清饥饿或预激活处理后获得核胞体 ,并注入去核卵母细胞内构建重组胚。检查重组胚 2 4h和 36h卵裂率以及 8d囊胚率 ,以评估供体细胞及其处理方法对体细胞核移植效果的影响。实验结果表明 :来自 3个年龄 (6、 18和 36月龄 )、 2个品系 (红安格斯肉牛和荷斯坦奶牛 )的 4头供体牛皮肤细胞重组胚的卵裂率和囊胚率均无差异。生长到完全汇合的 36月龄荷斯坦牛供体细胞血清饥饿 10～ 13d组重组胚的 36h卵裂率显著低于 0d (对照 )、 3～ 5d和 6～ 9d组 ,囊胚率显著低于 3～ 5d组 ;经 5 μmol/L离子霉素或7%乙醇预激活 5min重组胚的卵裂率和囊胚率均与对照组无差异。

受体卵母细胞来源和供体细胞类型对山羊体细胞核移植融合率的影响

以波尔山羊体细胞作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同供体细胞类型对核移植重构胚融合率的影响。结果:以体内成熟和FSH处理卵巢、屠宰场卵巢来源的体外成熟卵母细胞做核移植受体卵母细胞,重组卵的融合率分别为71.9%,78.4%,73.1%,三者之间差异不显著;以卵丘细胞和皮肤成纤维细胞做核供体,重组卵的融合率分别为77.1%,68.3%,二者之间差异显著。

供体细胞和去核卵母细胞的不同预激活对体细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究用细胞质内注射法构建重组胚,比较了离子霉素和乙醇预激活供体细胞和去核卵母细胞对重组胚卵裂和体外发育的影响。结果表明:与未经处理的对照组相比,离子霉素预激活供体细胞时重组胚的卵裂率和囊胚发育率有所提高;而供体细胞和去核卵母细胞同时用离子霉素预激活,重组胚的卵裂率无明显提高,囊胚发育率下降;用离子霉素或乙醇预激活去核卵母细胞,对重组胚的卵裂和发育无明显影响。

供体细胞培养处理方法对水牛核移植效果的影响

以经常规培养法 (DMEM+10 % FCS)、血清饥饿法 (DMEM+0 .5 % FCS培养 5～ 10 d)和 Apidicolin- APD结合血清饥饿法 (0 .1mg/ L APD培养 2 4 h,DMEM+0 .5 % FCS培养 1～ 18d)培养处理的水牛卵巢颗粒细胞和水牛成体耳部成纤维细胞作供核 ,分别采取带下注核法和胞质内注核法进行核移植。同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率 (以颗粒细胞作供核 )以及重组胚的囊胚发育率无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但经 APD+0 .5 % FCS培养处理供体细胞核移植后的分裂率显著高于其他组 (P<0 .0 5 )。用 7%乙醇处理的成体耳部成纤维细胞进行核移植 ,其重组胚的分裂率和囊胚发育率与对照组 (不含乙醇 )均无明显差异 (P>0 .0 5 )。结果表明 ,(1)血清饥饿处理水牛供体细胞对其核移植效果没有影响 ;(2 ) DNA合成抑制剂 APD结合血清饥饿培养处理水牛颗粒细胞和成体耳部成纤维细胞 ,可提高其核移植效果 ;(3)乙醇预激活处理水牛成体耳部成纤维细胞 。

供体细胞的不同选择和处理对重编程过程的影响

供体细胞核移入去核的卵母细胞后,必定要经过表观遗传修饰的重编程过程,回到胚胎开始发育的全能状态。若重编程过程不完全,必定会导致克隆效率降低。但是,体细胞核的重编程能力不仅仅是在其移入去核的卵母细胞后所体现,它在不同的供体细胞当中的潜能也是不尽相同的。并且,对供体细胞进行不同的处理,也会导致其重编程的能力和程度不同。文章首先阐述了供体细胞的类型、代数、周期、年龄以及物种的不同选择对其核移植后重编程过程的不同影响,其后又通过对供体细胞的冷冻保存,血清饥饿以及不同试剂的处理等方面对重编程过程所起到的作用作出了概况性的论述与分析。

绿色荧光蛋白作为供体细胞标记物的可行性

目的 :研究绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)的荧光稳定性及对转染细胞的影响 ,探讨其作为供体细胞标记物的可行性。方法 :将增强型GFP基因转入PC1 2细胞 ,经G4 1 8筛选并连续传代 ,在荧光显微镜下观察荧光蛋白阳性表达率 ;比较未转染细胞和转染细胞的形态、细胞活性、细胞周期等。结果 :第 5代、第 4 0代及未用G4 1 8筛选 3个月后的转染细胞 ,荧光蛋白阳性表达率为 1 0 0 % ;未转染细胞和转染细胞的形态无明显区别 ,细胞活性、细胞周期等差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :GFP荧光稳定 ,对转染细胞无明显影响 。

供体细胞对哺乳动物体细胞核移植的影响

哺乳动物体细胞核移植技术(克隆)在农业、生物技术、医药生产和濒危动物保护等方面具有很大的潜力和应用价值,已成为目前发育生物学研究的重要方法。文章依据近年来国内外在动物克隆技术方面的资料,分析了供体细胞类型、供体细胞动物年龄、供体细胞所处细胞周期、体外传代次数以及供体动物性别等因素对克隆动物效率的影响及可能原因。

供体细胞的选择与动物克隆效率研究进展

哺乳动物体细胞克隆经过几年的发展 ,已取得了很大进展 .已有多种细胞被采用并得到了克隆后代 .但动物克隆效率仍然很低 ,供体细胞的选择是动物克隆中的重要步骤 .供体细胞的细胞周期、细胞类型。

家兔供体细胞的发育周期与重构胚发育的关系

采用血清饥饿法处理体外培养的兔子胎儿成纤维细胞,并将其作为供体细胞移入去核卵母细胞内构建重构胚胎。检查供体细胞的细胞周期对重构胚的融合率、分裂率和着床率的影响。实验结果表明:培养基中血清含量在0.5%的情况下,G0/G1期的细胞比例由正常培养条件下(培养液中含有10%FCS)的73.2%明显地增加到86%以上。饥饿1-3天的细胞作为供体细胞构建重构胚时,可明显提高重构胚的融合率,但是不同的饥饿时间其融合率并无显著的差异。饥饿处理可明显增加重构胚的分裂率,以饥饿处理3天为最佳。

供体细胞的不同处理方法对牛核移植重构胚发育能力的影响

为了研究供体细胞不同的处理方法对核移植重构胚的作用,比较了用于保种的冻存和新鲜的成纤维细胞做供体细胞、供体细胞不同的离心转数、供体细胞不同的血清饥饿时间及用本实验室冻存的成纤维细胞,解冻复苏后,不同传代次数对重构胚的影响。结果表明分别用冷冻保存的和新鲜的成纤维细胞作为核供体,所得重构胚卵裂率、囊胚率无显著差异（P〉0.05）;供体细胞离心800 r/min时所得重构胚效果较好,离心1500 r/min所得重构胚的卵裂率、囊胚率与其他3组相比较低;血清饥饿3-5 d组所得重构胚比其他3组好;用解冻复苏后再传2、5代的细胞进行核移植,所得重构胚的卵裂率、囊胚率无明显差异（P〉0.05）,显著高于传8代的细胞所得重构胚。说明供体细胞的不同处理方法对核移植重构胚发育有很重要的影响。

供体细胞的传代次数和不同处理方法对异种核移植效率的影响

实验旨在探讨供体细胞培养代数及其所处的细胞周期对异种核移植效率的影响。以经Hochest33342染色后去核的牛卵母细胞为受体,以处于不同细胞周期的不同代数的人成纤维细胞为供体,采用电融合方法构建重构胚,6-DAMP和乙醇激活重构胚,SOFaa培养液中培养。第20代细胞非饥饿组的融合率、发育率显著低于第20代饥饿组(P<0.05),极显著的低于第8代细胞的饥饿组和非饥饿组(P<0.01),而8-细胞胚胎率,囊胚率4组间无显著差异。结果表明,饥饿处理对于培养代数低的细胞来说可能是非必要因素,但对于高代次细胞则是提高核移植效率的必要步骤,饥饿处理可使核移植融合率和发育率显著的提高。

供体细胞系基因座位特异DNA甲基化多态性及其与猪克隆效率的关联分析

利用甲基化限制性酶切试验(Combined bisulfite restriction analysis,COBRA)和亚硫酸盐转换PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP)后测序的方法,筛选猪体细胞克隆优势供体细胞提供基因座位特异的DNA甲基化遗传标记。比较8个发育重要基因的差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs)在不同克隆供体细胞系中的DNA甲基化多态性,并与猪克隆成绩进行关联分析。结果表明:除了XIST-DMR2和H19-DMR3 DNA甲基化变异幅度较小(低于10%)外,其他基因的相关座位均存在一定的COBRA多态性,其中,LINE1-DMR1、POU5F1-DMR1和NANOG-DMR1等3个差异甲基化化区域在克隆效率最高细胞系中处均处于最低程度的DNA甲基化状态,因此,可作为筛选猪体细胞克隆优势供体细胞系的潜在的DNA甲基化遗传标记。

供体细胞嵌合率的动态定量检测在供体淋巴细胞回输中的应用

为了探究供体细胞嵌合率 (DC)的动态定量检测在确定供体淋巴细胞回输 (DLI)时机和预测DLI疗效中的作用 ,应用复合扩增荧光标记STR PCR结合毛细管电泳方法 ,对 6例接受异基因造血干细胞移植后早期复发或移植物被排斥并接受DLI治疗的白血病患者 ,进行了DC的动态定量检测。结果发现 ,复发或排斥发生时 6位患者DC均出现大幅度下降 ,介于 2 7.3% - 85 .7% ,4位患者从DC下降 (<90 % )到出现临床复发或排斥的中位时间为2 6天 ,提示DC进行性下降的患者为复发或排斥的高危患者 ,可早期实施DLI干预治疗。 2例患者出现治疗反应 ,治疗有效患者在DLI后短期内出现DC回升 ,供体细胞占优势 ,并转化为稳定的完全供体细胞嵌合状态 (FDC) ,临床上出现移植物抗宿主病 (GVHD)表现。无效患者DLI后DC均无稳定回升现象 ,并对 3例DLI无效患者进行了第二次DLI治疗。结论 :嵌合体检测可指导DLI的实施时机 ,预测DLI的临床疗效 ,而且对首次DLI治疗无效的患者的后继强化治疗提供重要的参考依据。

哺乳动物体细胞核移植中供体细胞的研究进展

在哺乳动物体细胞核移植中,供体细胞是影响其效率的主要因素之一。供体细胞的类型、细胞周期、细胞的培养代数、冷藏与冷冻处理,以及供体动物的性别、年龄等都可能影响核移植胚胎的发育。根据现有资料,简要综述了在哺乳动物体细胞核移植中有关供体细胞的研究进展。

体细胞核移植的研究进展——核移植供体细胞与受体细胞的选择

根据近年来国外的研究进展,对核移植研究中的有关内容,如供体核的获得、受体卵母细胞与去核、核卵重组进行了综述,望能对核移植研究有所帮助。

供体细胞的不同处理及重组胚化学激活对体细胞克隆胚胎发育的影响综述

哺乳动物体细胞克隆经过几年的发展,已取得了很大进展。已有多种细胞被采用并得到了克隆后代。但动物克隆效率仍然很低,供体细胞的选择和重组胚激活是动物克隆中的重要步骤。供体细胞的细胞周期、细胞类型、冷冻处理和化学激活等方面都可能影响动物克隆的效率。

哺乳动物体细胞核移植中供体细胞的研究进展

本文对哺乳动物核移植供体细胞的研究进展进行了综述。主要涉及细胞类型、细胞年龄和细胞所处的周期时相对核移植胚胎发育的影响 。

猪核移植供体细胞的分离培养及传代的研究

通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究，摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法，建立了猪的供体细胞系。研究结果表明：猪的卵丘细胞单层的生长需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞，组织块法单层的生长需要10～11d，酶消化法需要8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。

供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。