基因组编辑技术中供体DNA类型及选择

基因组编辑技术能够实现基因组的精确修饰和改造,是后基因组时代研究基因功能和遗传信息的主要手段。传统的基因打靶技术通过低效率的细胞自发同源重组实现目的基因的定点修饰。真核细胞中DNA双链断裂介导的同源重组效率远高于自发同源重组,利用人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂,通过提供适当形式的、含有一定长度同源臂的供体DNA,能够实现相对高效的基因组靶向编辑。本文系统总结了环状质粒、线性化质粒、聚合酶链式反应产物及单链寡聚脱氧核苷酸4种类型的供体DNA在基因组精确编辑研究中的应用及候选原则,以期为以后相关研究中供体DNA的选择、设计提供参考和借鉴。

供体来源细胞游离DNA在移植肾损伤监测应用中的研究进展

供体来源细胞游离DNA(donor-derived cell-free DNA, dd-cf DNA)是指供体细胞凋亡或坏死后释放到体液中的游离DNA,近年来成为了监测移植物损伤的新兴生物标志物之一。本文从供体来源细胞游离DNA的相关临床研究报道进行综述,较全面的总结了供体来源细胞游离DNA的临床应用现状,为其合理使用提供理论参考依据。

供体来源细胞游离DNA在肾移植中的研究

肾移植是终末期肾病有效治疗手段。移植物损伤是影响移植物存活的主要因素。常用方法如监测血清肌酐、尿蛋白及移植肾活检等,存在迟滞性,不确定性及有创性。供体来源细胞游离DNA(donor-derived cellfree DNA,dd-cfDNA)是一种源于供体的碎片化、可降解DNA片段。现有研究发现,dd-cfDNA在移植肾损伤监测、移植物排斥鉴别、免疫抑制方案调整等方面发挥重要作用,是一种无创、可重复且灵敏度高的新型生物标志物。本文就近年来dd-cfDNA在肾移植的研究进展做一综述。

一种新型提高HDR效率的 CRISPR/Cas9-Gal4BD 供体适配基因编辑系统

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。

供体来源细胞游离DNA鉴别移植肾急性排斥反应类型

目的探讨血浆供体来源的细胞游离DNA(donor-derived cell-free DNA,dd-cfDNA)片段在鉴别移植肾T细胞介导的排斥反应(T cell-mediated rejection,TCMR)和抗体介导的排斥反应(antibody-mediated rejection,ABMR)中的价值。方法回顾性纳入2017年12月1日至2019年7月18日在浙江大学医学院附属第一医院经肾活检确诊的移植肾急性排斥反应患者。根据2017年Banff移植肾排斥反应病理分类诊断标准将患者分为ABMR组和TCMR组,后者又分为TCMRⅠ型亚组和TCMRⅡ型亚组。采用二代测序+目标区域捕获的方法检测入选者外周血浆dd-cfDNA水平。比较两组患者人口学及临床病理指标的差异。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)评价血浆dd-cfDNA和血肌酐水平对鉴别两种移植肾ABMR和TCMR的诊断价值。结果共60例移植肾急性排斥反应患者入选本研究,TCMR组42例,ABMR组18例。ABMR组患者血浆dd-cfDNA百分比较TCMR组显著升高[2.33(1.19,4.30)%比0.98(0.50,1.82)%,P=0.001];ABMR组dd-cfDNA绝对值亦较TCMR组显著升高[0.94(0.60,2.27)ng/ml比0.43(0.20,0.96)ng/ml,P=0.003]。ROC曲线分析结果显示,dd-cfDNA百分比鉴别诊断TCMR和ABMR的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.76(95%CI 0.64~0.88),阈值为1.11%,敏感性88.89%,特异性59.52%;dd-cfDNA绝对值鉴别诊断TCMR和ABMR的AUC为0.74(95%CI 0.61~0.86),阈值为0.53 ng/ml,敏感性88.89%,特异性54.76%。TCMR亚组与ABMR组血浆dd-cfDNA水平的比较结果显示,TCMR两亚组间dd-cfDNA百分比及绝对值水平的差异均无统计学意义(均P>0.05);ABMR组dd-cfDNA百分比显著高于TCMRⅠ型亚组(P=0.008)和TCMRⅡ型亚组(P=0.030)。ABMR组dd-cfDNA绝对值显著高于TCMRⅠ型亚组(P=0.003)。结论血浆dd-cfDNA水平检测对鉴别ABMR和TCMR两种排斥反应类型有辅助诊断价值。

供体来源游离DNA检测在肾移植中临床应用的专家共识(2022版)

游离DNA(cfDNA)反映其来源细胞的病理生理状态,已经广泛应用于肿瘤和产前基因检测。在器官移植领域,供体来源游离DNA(ddcfDNA)作为一种无创"液体活检"标志物在肾移植中越来越被重视,其在各种疾病状态中的价值和意义逐渐被阐释。中国肾移植供体来源游离DNA应用与研究专家组和中国医药生物技术协会移植技术分会组织相关专家参考国内外最新进展,结合我国肾移植临床实际撰写了初稿,广泛征求国内本领域临床一线专家修改意见后统稿完成本共识。共识围绕cfDNA检测与ddcfDNA计算、标本留取规范、ddcfDNA绝对值和相对值的意义、ddcfDNA与移植肾排斥反应(包括与移植肾损伤/排斥反应、供体特异性抗体、亚临床排斥反应、移植肾活检病理的关系、在诊断小管间质性TCMR的作用)、动态ddcfDNA的监测意义、ddcfDNA与儿童肾移植、重复肾移植、肾小球滤过率、移植肾BK多瘤病毒感染及ddcfDNA检测的影响因素等十个方面进行了论述,并给出了相关专家推荐意见。

器官移植术后供体来源细胞游离DNA监测的研究进展

器官移植是治疗终末期器官疾病的唯一治愈手段。器官移植术后患者需要接受长期的免疫抑制治疗并适时调整免疫抑制剂方案以维持移植物功能稳定。供体来源细胞游离DNA（donor-derived cell-free DNA，ddcfDNA）是一种来源于移植器官细胞的游离胞外DNA。器官移植术后，ddcfDNA可在受体血液、尿液中检测到。研究发现ddcfDNA含量在器官移植术后患者发生急性排斥反应时甚至经活组织检查诊断数周前已发生实质性增高，表明其作为一种非侵入性、早期诊断移植物损伤的生物标记物具有较高的临床应用价值。本文将结合已有的相关研究对ddcfDNA在移植物监测中的应用进展作一综述。