熊果酸联合供者特异性淋巴细胞输注诱导小鼠免疫耐受

核因子kB（nuclear factor—kB，NF-kB）是T细胞活化重要信号分子。我们前期研究发现T细胞特异性NF-kB活化障碍小鼠——IkBα△N．Tg小鼠，能够永久接受异基因心脏移植物。本研究将探讨以NF-kB为干预靶点的小分子化合物——熊果酸对小鼠异基因心脏移植的影响。实验方法如下：（1）流式细胞术分选获取C57BL／6（B6）脾脏T细胞并于体外培养。

HBV特异性T淋巴细胞输注治疗慢性乙型肝炎临床研究

目的 :为探讨HBV特异性T淋巴细胞疗法的抗病毒疗效。方法 :应用此疗法治疗慢性乙型肝炎 15例 ,观察治疗后肝功能、乙肝病毒标记物 (HBVM)、细胞免疫、可溶性白细胞介素 2受体 (sIL - 2R)水平变化 ,并追踪随访 1年。结果 :经该疗法治疗后患者HBsAg、HBeAg、HBVDNA滴度均有下降 ,以随访 6个月时最明显 (P <0 .0 5 )。随访 12个月时HBeAg转阴 6例(4 0 .0 0 % ) ,HBVDNA转阴 6例 (4 0 .0 0 % )。治疗后CD8明显升高 (P <0 .0 5 ) ,完全反应者 ,sIL - 2R水平明显升高 (P <0 .0 5 )。结论 :HBV特异性T淋巴细胞输注疗法有抗病毒作用及近期疗效。

抗γc单克隆抗体联合供者特异性输注延长移植物存活

目的探讨抗γ公共链单克隆抗体(抗γc单抗)联合供者脾细胞特异性输注(DST)诱导移植物长期存活的可行性及相关机制。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,组Ⅰ为单纯实施心脏移植组,组Ⅱ于移植前给予DST,组Ⅲ术前予DST联合抗γc单克隆抗体处理,术后观察移植物的存活时间及相关指标。结果组Ⅲ心脏移植物平均存活时间明显长于组Ⅰ及组Ⅱ(P<0.05)。FACS分析显示组Ⅲ受者脾细胞中Tr比例较组Ⅰ及组Ⅱ显著增高(P<0.05),同时脾细胞增殖活性明显减低(P<0.05)。结论抗γ公共链单克隆抗体联合DST通过增加供者体内Tr的比例,减低对同种抗原的应答能力,显著延长同种心脏移植模型中移植物存活时间。

南京地区HPA、HLA已知基因型血小板供者资料库的建立与库容分析

目的建立南京地区人群HPA、HLA已知基因型血小板供者资料库,从群体资料分析本地人群血小板HPA-1~6w、-15和HLA-A、-B的等位基因多态性,推算患者基因配合的匹配概率与适宜本地的库容水平。方法分别采用PCR-SSP和PCR-SBT方法对HPA-1~6w、-15和HLA-A、-B进行基因分型;应用SHEsis在线软件统计分析HPA-1~6w、-15和HLA-A、-B的等位基因频率与单倍型频率;依次推算找到HPA、HLA匹配供者的概率与适宜的库容大小。结果获得了南京地区HPA-1~6w、-15和HLA-A、-B群体多态性资料;根据统计结果评估,在不考虑ABO同型的情况下,当血小板供者库容为527人时,单倍型频率>0.001的患者有95%的概率在库中找到至少1例HPA-1~6w、-15相匹配的供者。建立1个库容为1875人的血小板供者库可满足单倍型>0.001的患者有95%的可能找到至少1例HLA-A、-B相合的供者。结论建立了本地区血小板献血者HPA、HLA基因资料库,为后续血小板库的扩建、维护与临床应用提供了重要的数据支持。

MASPAT配型相合血小板输注无效的异基因造血干细胞移植患者的血小板输注策略

目的:探讨异基因造血干细胞移植患者血小板抗体固相凝集法(MASPAT)配型相合血小板输注无效的原因及血小板输注策略。方法:选取1例因输血诱导产生供者特异性HLA抗体(DSA),且该DSA导致患者移植失败和MASPAT配型相合血小板输注无效的案例,详细分析该患者血小板输注无效原因及血小板输注策略。结果:患者女,32岁,以“发热、白细胞减少”为主要表现起病,于外院明确诊断为急性髓系白血病(高危),化疗缓解后拟行造血干细胞移植入院。在化疗过程中,患者因输注血小板产生DSA,且该DSA存在与首次移植供者不合的HLA基因位点,导致首次移植原发植入失败。该患者在移植前后多次进行血小板输注,结果显示,MASPAT配型相合血小板输注有效率仅为35.3%,进一步分析血小板输注无效的原因为MASPAT方法漏检了抗体。行二次造血干细胞移植时,选择了DSA-供者,且规避初次移植过程中配型相合但输注无效的血小板,结果该患者移植成功,顺利出院。结论:DSA可引发移植失败或使移植物失功。对于已经产生DSA的患者,在输注血小板前仅采用MASPAT配型相合的血小板输注策略会漏检抗体,导致血小板输注无效。

输注TGF-β1基因修饰的供体脾细胞诱导同种大鼠移植心脏耐受的实验研究

目的:研究TGF-β1修饰的供者脾细胞特异性输注对同种大鼠移植心脏耐受的诱导及效果。方法:建立同种大鼠异位心脏移植模型,用脂质体转染TGF-β1基因修饰供者脾细胞;观察TGF-β1修饰的脾细胞输注组,单纯脾细胞输注组和假处理组移植心脏存活天数和病理改变。结果:建立了稳定转染TGF-β1基因的脾细胞;TGF-β1修饰的脾细胞特异性输注可明显延长移植心脏存活时间(17.0±3.3)d,与单纯脾细胞输注组(7.0±1.1)d和假处理组(6.3±1.0)d比较,差异有显著性(P<0.05);而且可明显减轻同种移植心脏的病理损伤。结论:输注TGF-β1基因修饰的供体脾细胞可诱导同种大鼠移植心脏的耐受产生。

陕西地区血小板供者基因数据库拓展性应用的研究

目的通过分析本地区无偿献血与造血干细胞捐献群体之间的共性和特性,挖掘包括血小板基因供者库在内的无偿献血者与造血干细胞捐献者资料库间的融合潜力,提高招募成功率和已知结果库存率。方法应用数据库建模和比对方法对本市近10年无偿献血者与中华骨髓库陕西分库造血干细胞捐献者之间的匹配度和融合度进行筛选分层,采用Arlequin 3.5.2.2软件计算HLA、HPA基因频率及单体型频率,并根据表型频率计算不同血小板供者后备库中找到HLA、HPA全匹配供者概率。结果在本地区已入库造血干细胞志愿捐献者中,依据其献血行为挖掘出的活跃献血者分别划分为血小板供者库后备一、二、三、四梯队,分别为696名、2752名、9092名和12028名捐献者。第一梯队具有10~50次血小板捐献经历和10~20次全血捐献经历的占比最高,分别为13.65%和26.01%;第二梯队具有10~20次全血捐献经历和10~50次血小板捐献经历者占比分别为15.04%和1.38%,与其他梯队献血特征有差异(P<0.05)。在现有血小板库+一二梯队的核心库容中(n=4955),患者找到至少1名HLA-A,B表型相同的供者的概率可达69.02%;当考虑到ABO和HPA同型时,找到至少1名HLA、HPA全相合且ABO同型供者概率(B型为例)为48.73%。结论西安地区全血捐献、单采血小板捐献和造血干细胞捐献这3类群体存在较大交叉分布性,与从头开始扩充库容相比,造血干细胞捐献者资料库中的活跃献血者是血小板供者库的后备有声力量,在扩大有效库容的同时能够最大限度降低建库成本和资源需求。

HLAⅠ基因型配合输注策略用于免疫性血小板输注无效的实验研究

目的利用血小板供者HLA基因分型库,针对PTR患者建立供受者HLA-A、B位点基因配合型输注策略,以提高临床血小板输注疗效。方法以血清学交叉配合试验作为免疫性PTR的初筛手段,对初筛阳性的35例PTR患者采取血小板基因配型策略,其中24例进行HLA-A、-B基因分型和血小板HLAⅠ类抗体检测,根据患者血小板基因型和供者特异性抗体(DSA)回避策略以及供受者CREG配合等级原则,在单采血小板因型数据库中搜寻配合型供者,其中DSA回避优先于CREG等级原则,共计83次输注。其余11例患者仅按照HLA交叉反应组CREG的配合等级原则选择供受者HLA-A,-B抗原基因型相合的供者,共计55次输注。回访临床患者相关资料及基因配型的血小板输注效果,统计分析校正的血小板计数增值(CCI)。结果对临床送检的35例PTR患者先后进行了453次ABO同型的血清学交叉配合试验,人均为12.94次(453/35),每次血小板交叉配型的供者平均人数为4.21(1908/453)人,血清学交叉配合试验阳性率为69.86%(1333/1908)。其中对24例患者标本进行了HLAⅠ类抗体检测,仅有1例标本为抗体阴性,即HLAⅠ类抗体阳性检出率为95.83%(23/24),且平均每个患者有(44.37±22.31)种特异性抗体;根据患者血清中抗体荧光强度值的高低,抗体为强阳性17例、阳性20例、弱阳性23例,其对应的检出率分别为73.91%(17/23)、86.96%(20/23)和100%(23/23)。138次HLA基因配合型输注后的血小板首次计数CCI均值为14.08±11.12[(23.95±21.28)h],高于1h CCI(>7.5有效)或24h CCI(>4.5有效),且DSA回避组输注效果(首次计数CCI为15.56±11.00)显著优于非DSA回避组(首次计数CCI为11.86±12.00)(P<0.05)。在所有患者输注中,49.28%的输注同时存在1种或多种非免疫因素。结论HLA-I基因配型血小板输注策略是预防和改善免疫相关性血小板输注无效的可行方法,对于多次输血且血小板相关抗体初筛阳性的患者,采取DSA回避和供受者CREG配合型输注策略可显著提高输血疗效,为临床提供血小板精准输注。

Eplets配型方法在HLA-Ⅰ类抗体所致血小板输注无效患者中的应用评价

目的了解Eplets配型方法在HLA-Ⅰ类抗体所致血小板输注无效（PTR）患者中的适用性。方法以PCR-SBT方法检测24名PTR患者及血小板供者的HLA基因型;利用Luminex技术平台、采用抗-HLA检测试剂（LSA）检测患者的HLA特异性抗体（DSA）;再借助HLA Matchmaker软件获得患者的预存HLA-Ⅰ类抗体对应的表位（Eplets）及DSA荧光指数中值（MFⅠ）;最后统计分析Eplets错配数对PTR的影响。结果对DSA不同MFⅠ阈值（1 000—3 000）的统计分析：DSA MFⅠ〈1 000时的血小板输注效果最佳,且随着DSA MFⅠ的增加,血小板输注效果均出现不同程度的下降。本组32次输注有效与PTR患者的DSA MFⅠ平均值分别为1 289.67±1 121.83 vs 4 078.60±2 578.57（P〈0.01）,Eplets错配数0—5的患者与错配数〉5的患者输注效果分别为29.38±22.47 vs 18.47±15.38（P〉0.05）。结论 Eplets配型方法结合DSAMFⅠ水平可筛选到适合的血小板供者,从而避免对于HLA-Ⅰ类抗体所致的PTR,保证输注效果。

陕西地区血小板HLA/HPA基因供者库的建库评估及应用策略

目的探讨陕西地区血小板HLA/HPA基因供者库合适的库容水平及匹配概率,为本地区血小板供者库的建设、维护及应用提供数据支持。方法以11755名中华骨髓库陕西分库造血干细胞志愿捐献者、401名和249名陕西地区无血缘关系多次单采血小板捐献者为对象,分别进行HLA基因多态性分析、HPA基因分型和CD36抗原检测,应用Arlequin 3.5.2.2软件计算HLA、HPA基因频率及单体型频率,并根据表型频率计算找到HLA、HPA全匹配供者概率,评估库容水平。结果获得了陕西地区HLA-A、-B及HPA1-6、10、15、21表型群体多态性资料,在249例健康捐献者中检测到CD36抗原Ⅰ型和Ⅱ型缺失频率均为0.40%(1/249);计算推导得到当血小板供者库库容为194人时,患者有95%的把握能在该库中找到至少1名HPA1-6、10、15、21全匹配供者;1个1500人的血小板供者库有95%的概率可以找到1名HLA-A-B表型频率>0.002或单体型频率>0.001的相同供者,而找到任何1个交叉反应组(CREG)匹配的供者概率应在44.95%~97.57%之间;当供者数为8856、15033时,患者找到1名HLA表型相同的供者的概率可提高至80%和90%。结论在可靠的群体性多态性资料的支撑下,不同地区人群HLA/HPA的分布差异使得各地血小板供者库的建库模式和最适库容不尽相同,有必要应用多种血小板配合型输注策略扩大供者选择范围,从而有效降低建库成本和资源需求。

免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导肝移植受体长期存活的研究

目的研究他莫克司(FK506)、霉酚酸酯(MMF)、抗CD28单克隆抗体(anti-CD28mAb)为主要免疫抑制方案联合供体骨髓输注,对大鼠肝移植受体存活时间的影响。方法建立大鼠原位肝移植模型:①A组(n=6):同品系移植,供、受体同为W istar大鼠或SD大鼠;②B组(n=14):W istar大鼠为供体,SD大鼠为受体(W istar→SD),术后不采取任何治疗措施;③C组(n=7):W istar→SD,术后FK506、MMF联合应用2 d;④D组(n=6):W istar→SD,术后FK506、MMF联合应用2 d,然后单独应用FK506共4 d;⑤E组(n=6):W istar→SD,术后供体骨髓输注,其余处理同D组;⑥F组(n=3):W istar→SD,术后供体骨髓输注,术后第1天应用1次anti-CD28mAb,FK506、MMF术后联合应用2 d,然后单独应用FK506共2 d。观察各组移植物的存活和排斥发生情况及其组织病理学改变。结果A组大鼠均存活100 d以上;B组大鼠死于急性排斥反应,中位存活时间为15.5 d;C、D组大鼠中位存活时间分别为46 d和68 d;E、F组大鼠均存活100 d以上,组织病理学检查门静脉周围和肝组织内未见明显炎症细胞浸润。结论W istar大鼠与SD大鼠间肝移植,属于高免疫排斥型动物组合,可作为大鼠肝移植免疫排斥和免疫耐受研究的有效品系组合;移植同时供者骨髓细胞的输注可获得移植肝的长期存活;anti-CD28mAb和短时间FK605、MMF联合应用具有协同作用。

供者特异性抗原静脉输注联合抗γ链单克隆抗体诱导小鼠皮肤移植物免疫耐受

目的 探讨静脉输注供者特异性抗原联合抗白细胞介素2受体(IL 2R)γ链单克隆抗体诱导移植免疫耐受的可行性。方法 在C57BL/6小鼠建立H Y皮肤移植模型,术前7 d给予5×106个供者脾细胞静脉输注,并分别于术前6 d和4 d给予抗白细胞介素2受体γ链单克隆抗体(4G3、3E12及TUGm2各0.5 mg)和抗IL 2Rβ单克隆抗体(TM β1,0.5 mg)混合液2.0 mg腹腔注射,以单纯行H Y皮肤移植模型和静脉输注供者特异性抗原的H Y皮肤移植模型为对照,观察皮肤移植物的存活时间。结果 联合给予抗白细胞介素2受体γ链单克隆抗体和供者特异性抗原输注组的皮肤移植物存活时间均超过100 d,显著长于单纯H Y皮肤移植组的33.42 d(P<0.01)及仅输注供者特异性抗原H Y皮肤移植组的14.71 d(P<0.01)。结论 在H Y皮肤移植模型中,静脉输注供者特异性抗原联合抗白细胞介素2受体γ链单克隆抗体可以成功地诱导受者对皮肤移植物的免疫耐受。

DST诱导外周耐受小鼠不同组织细胞内NF-κBp65的活性变化

目的:探讨NF-κB在外周耐受发生中的活性改变及其意义。方法:以BALB/c小鼠为供者,输注1×108个供者脾细胞3d和7d的C3H小鼠为受者,建立皮肤移植模型。每天观察移植物的生长情况并于术后第7天取移植皮片和脾脏,通过对移植物的存活时间、组织病理学检查和抗原特异性淋巴细胞增殖试验来了解免疫功能的改变;以免疫组化染色法检测小鼠脾脏和皮肤移植物中NF-κBp65活性的变化。结果:供者特异性脾细胞输注后第7天进行手术,可使皮肤移植物的存活时间延长、抗原特异性淋巴细胞增殖反应明显受抑制;皮肤移植物中NF-κBp65的活性增加,脾脏NF-κBp65的活性降低。结论:输注供者特异性脾细胞诱导的外周耐受,可能与不同部位的免疫细胞内NF-κBp65活性改变有关。

肾移植术后早期淋巴细胞及DSA监测在诊断移植排斥反应中的意义

目的分析并监测肾移植术后早期急性排斥反应(AR)患者淋巴细胞亚群比例,供者特异性抗体(DSA)及非供者特异性抗体(NDSA)水平,为临床预防排斥反应的发生、早期诊断排斥反应,以及制定合理的个体化免疫抑制治疗方案、评估治疗效果提供可靠依据。方法选择2014年1月至2016年6月肾脏移植受者454例,采用流式细胞计术及Luminex技术对肾脏移植受者术后淋巴细胞比例、DSA及NDSA进行动态监测,应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果 454例受者中,33例术后6个月内发生AR(AR组),421例肾功能稳定(SF组)。肾脏移植受者AR发生时,外周血CD4+T/CD8+T比值(2.81±0.85 vs 1.39±0.94,t=7.336,P<0.001)及B细胞百分比[(15.79±3.53)%vs(10.2±3.04)%,t=4.986,P<0.001]显著高于SF组。HLA抗体中位荧光强度(MFI)的监测发现,AR患者在移植术后1周左右HLA抗体水平逐渐升高,与SF组MFI相比,差异有统计学意义(P<0.05)。AR患者排斥反应发生时抗体MFI值为7 559±1 496,治疗后为3 023±996,差异有统计学意义(t=13.853,P<0.001)。DSA-/NDSA-患者AR发生率为3.1%(11/357);DSA-/NDSA+患者AR发生率为14.5%(12/83);DSA+/NDSA+患者AR发生率为71.4%(10/14),与前两者相比差异有统计学意义(P<0.001)。结论肾脏移植术后早期监测CD4+T/CD8+T比值及B淋巴细胞百分比的变化及血清DSA/NDSA水平对于AR诊断和预警具有一定的指导价值。

基于免疫性PTR的血小板膜糖蛋白及T/B淋巴细胞表达水平研究

目的:探究血小板膜糖蛋白及T/B淋巴细胞免疫在免疫性血小板输注无效发生机制中的重要作用。方法:采用血小板特异性抗体检测试剂盒及流式细胞技术检测免疫性PTR患者血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPIa/Ⅱa、抗GPIb/Ⅸ、抗GPⅣ)、血小板膜糖蛋白(CD36、CD61、CD41a)表达情况及外周血T/B淋巴细胞数量,运用SPSS19.0软件及R软件分析免疫性PTR与血小板膜糖蛋白、外周血T/B淋巴细胞的相关性。结果:免疫性PTR与血小板输注有效者比较,血小板特异性抗体的产生无显著差异,血小板膜糖蛋白CD36和CD61的表达具有显著差异,CD36对免疫性PTR发生风险具有极大的预测价值,外周血CD8^(+)T细胞比例增高,而CD4^(+)T细胞比例减低。结论:免疫性PTR患者产生血小板抗体具体机制不明确,了解患者细胞免疫状态有助于明确免疫性PTR的发生机制,为患者提供更优质的诊疗策略。

术前受者外周血中抗原特异性单个效应细胞频数对急性排斥反应的影响

目的探讨术前受者外周血抗原特异性单个效应细胞频数与肾移植后急性排斥反应的关系。方法采用酶联免疫斑点实验方法,检测8名健康志愿者及25例肾移植受者术前外周血淋巴细胞经同种异体抗原刺激后分泌特异性细胞因子(γ干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4和白细胞介素5)的单个效应细胞频数,并对25例受者肾移植后的情况进行随访,时间至少为半年。结果8名健康志愿者外周血中分泌γ干扰素(INFγ)的细胞的频数最高,为15/500000～120/500000,其频数在连续4个月内相对稳定。受者术前体内存在的供者特异性的、分泌INFγ的细胞频数与供、受者间HLA配合情况无关;25例肾移植受者中,21例移植术后均未发生急性排斥反应,其术前供者特异性的、分泌INFγ的细胞频数除2例外,均低于40/500000;4例术后发生急性排斥反应,术前供者特异性的、分泌INFγ的细胞频数分别为86/500000、104/500000、128/500000及264/500000。结论移植术前测定受者体内供者特异性的、分泌INFγ的细胞频数可以作为评估受者针对供者的特异性免疫反应能力的方法之一,并为术后急性排斥反应的防治提供参考。

调节性B淋巴细胞在免疫耐受中作用的研究进展

虽然免疫抑制剂能够改善肾移植受者的早期预后，但移植物的远期存活率并未得到明显提高，移植物10年存活率仅有50％。免疫抑制剂的不良反应是导致移植物功能丧失及受者死亡的重要因素。因此，诱导受者对供者特异性的免疫耐受是解决这些问题的根本途径。近几年来虽然诱导免疫耐受的临床工作已取得了较大的进展，

供者特异性抗体与补体活化是影响移植肾长期存活的关键因素

上世纪中叶，器官移植技术兴起的早期人们就对排斥反应发生的原因进行过激烈的争论。以Gorer为代表的一方认为，是抗原抗体结合导致了移植物的排斥反应；而以Medawar为代表的另一方则认为，由T淋巴细胞介导的细胞免疫才是引起排斥反应的关键。两种理论的根本区别在于，造成移植物直接损害的究竟是抗体还是T淋巴细胞，或者说究竟是体液免疫还是细胞免疫介导了排斥反应争论持续了多年，器官移植免疫学在争论中发展起来。