依托泊苷诱导蛋白2.4调控iNKT细胞的发育和IFN-γ应答（英文）

iNKT细胞是一类特殊的固有样T淋巴细胞,在感染、肿瘤、自身性免疫疾病和代谢类疾病中都发挥重要的调控作用.揭示调控iNKT细胞发育、分化和功能的细胞分子机制,对于阐释iNKT细胞与疾病的关系以及寻求可能的治疗途径都具有重要的意义.依托泊苷诱导蛋白2.4 (Etoposide-induced protein 2.4,Ei24)可调控细胞生长、凋亡和自噬等多种生物学功能,但其对iNKT细胞的发育和功能的影响仍不清楚.本研究利用Cre/loxP重组酶系统成功构建T细胞中Ei24特异性敲除小鼠.敲除Ei24后,iNKT细胞在胸腺中的发育受到明显抑制,肝脏和脾脏等组织中的iNKT比例和数目明显减少.进一步研究发现,Ei24主要影响iNKT1和iNKT17 2个亚群,对iNKT2的调控作用相对较小.当腹腔注射iNKT细胞特异性活化抗原α-GC后,敲除Ei24后iNKT细胞的IFN-γ应答更低,但不影响i NKT细胞的IL-4应答.以上结果表明,Ei24可以调控iNKT细胞的发育与功能.

含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1降解依托泊苷诱导蛋白24并促进肝癌细胞增殖

目的筛选含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1(WWP1)相互作用蛋白,探讨WWP1和依托泊苷诱导蛋白24(EI24)对肝癌细胞增殖的影响。方法利用酵母双杂交的方法筛选与WWP1相互作用的蛋白,并利用免疫共沉淀来进行相互作用验证。通过体内泛素化实验验证泛素连接酶WWP1与EI24酶和底物的关系。以慢病毒感染的方法建立WWP1和EI24稳定过表达或敲低表达的肝癌细胞系。通过细胞增殖实验、平板克隆实验和裸鼠成瘤实验检测WWP1和EI24对肝癌细胞增殖的影响。结果WWP1可以与底物EI24相互作用,并能够在体内将EI24泛素化降解。成功构建稳定过表达或敲低表达的WWP1和EI24的肝癌细胞系HepG2。在HepG2细胞中,过表达WWP1可以降低内源EI24的蛋白水平,而敲低WWP1可以使EI24蛋白水平增加。细胞计数盒8(CCK-8)法检测结果表明,在36 h时,WWP1过表达组和shWWP1组细胞的相对增殖活性分别为(347.00±8.15)%和(187.08±4.86)%,与对照组(270.33±15.01)%比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在36 h时,EI24过表达组和shEI24组细胞的增殖活性分别为(183.75±8.11)%和(317.33±9.60)%,与对照组(270.33±15.01)%比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。克隆形成实验结果显示,对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的克隆形成数分别为(52±7)个/视野、(76±4)个/视野和(19±3)个/视野,WWP1过表达组细胞克隆形成明显增多(P<0.05),而敲低WWP1后细胞克隆形成较对照组减少(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的克隆形成数分别为(38±4)个/视野、(10±3)个/视野和(69±7)个/视野。与对照组比较,过表达EI24使细胞克隆形成明显减少(P<0.05),敲低EI24的表达使细胞克隆形成明显增多(P<0.05)。裸鼠体内实验结果显示,经过4周同等条件喂养后,对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1400.00±43.71)mm3、(2636.67±290.45)mm3和(642.17±36.00)mm3,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.23±0.08)g、(2.05±0.17)g和(0.88±0.09)g,差异均有统计学意义(P<0.05)。WWP1过表达组细胞成瘤能力明显增强,shWWP1组成瘤能力明显减弱。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1245.17±93.10)mm3、(662.17±60.88)mm3和(1986.67±226.75)mm3,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.15±0.04)g、(0.85±0.02)g和(1.73±0.05)g,差异有统计学意义(P<0.05)。EI24过表达组细胞成瘤能力明显减弱,shEI24组成瘤能力明显增强。结论WWP1可以靶向底物EI24进行泛素化降解,并促进肝癌细胞的增殖。

橙皮苷调控EI24 Th1/Th2细胞比例对抗肺纤维化作用及可能机制研究

目的:通过观察橙皮苷对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的保护作用,并从依托泊诱导蛋白2.4(EI24)基因和Th1/Th1平衡方面探讨其相关机制。方法:将60只大鼠随机分成6组:假手术组、模型组、吡非尼酮组(阳性对照,0.12g/kg吡非尼酮)、低剂量橙皮苷组(12mg/kg)、中剂量橙皮苷组(24mg/kg)和高剂量橙皮苷组(36mg/kg),每组10只。采用气管内注射博莱霉素建立肺纤维化大鼠模型。采用小动物呼吸机检测大鼠的肺功能指标用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)、呼气流量峰值(PEF)。采用苏木精伊红染色和Masson染色进行病理组织学评估。2023年2月采用酶联免疫吸附实验检测大鼠肺组织细胞因子水平。2023年2月采用流式细胞术分析大鼠肺组织中辅助T细胞(Th)亚群的占比情况。2023年2月采用蛋白免疫印迹检测肺组织中EI24蛋白的表达。结果:与模型组相比,橙皮苷处理组大鼠的FVC、FEV1、PEF均明显升高,且肺指数明显降低(P<0.05)。相较于模型组,橙皮苷处理组大鼠肺组织损伤、炎症浸润、肺纤维化和胶原沉积明显减少,且肺组织中TGF-β1、Col I、HYP、IL-6和TNF-α含量均明显降低(P<0.05)。与假手术组相比,模型组EI24 mRNA和蛋白表达显著降低;与模型组相比,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组中EI24 mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.05)。此外,与模型组相比,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组大鼠肺组织中Th1细胞亚群占比明显升高,而Th2细胞亚群占比明显降低(P<0.05)。同时,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组肺组织中IFN-γ水平显著升高,而IL-13和IL-4水平显著降低(P<0.05)。结论:橙皮苷能够减弱博莱霉素诱导的炎症细胞浸润、促炎细胞因子释放和ECM过度沉积,从而改善大鼠肺纤维化进程,其机制可能是通过调控EI24和Th1/Th2免疫细胞平衡来实现。