依纽小单孢菌接合转移体系的构建

以依纽小单孢菌HP变种基因组DNA为模板,扩增位于西索米星3',4'-双脱羟基酶基因sisI上下游序列的两端同源交换臂,在两臂之间添加抗性筛选标记ermE基因,并在该基因上游加入组成型强启动子ermE*,以强化筛选标记。将该外源DNA序列插入到质粒pKC1139,构建重组质粒pFD57。转化大肠杆菌ET12567后,经接合转移导入依纽小单孢菌中,经抗性筛选得到两株阳性菌株,命名为HP-I-1和HP-I-2。经PCR验证和测序,结果表明,重组质粒已整合到染色体DNA上。依纽小单孢菌接合转移体系的构建达到了预期目的,并实现了对该体系的优化。

sisI替换genP在绛红小单孢菌G1008中的功能表达

将依纽小单孢菌3′,4′-双脱羟基基因sisI组合到绛红小单孢菌G1008中,替代其中的同工异源酶基因genP,研究sisI基因异源表达的内在特征.以温敏型质粒pKC1139作为克隆载体,构建sisI替换genP的重组质粒pIP303,利用接合转移技术,将穿梭质粒导入绛红小单孢菌G1008基因组,影印筛选并通过PCR(聚合酶链式反应)鉴定,获得一株基因重组工程菌GIP95.借助TLC(薄层色谱)、HPLC(高效液相色谱)和MS(质谱)检测代谢产物组分及结构变化,结果表明突变株GIP95的代谢流未被阻断,仍能够合成庆大霉素C族组分.由此得出结论,外源基因依纽小单孢菌3′,4′-双脱羟基基因sisI参与了庆大霉素生物合成中绛红糖胺3′,4′-双脱羟基这一关键步骤,在绛红小单孢菌G1008中实现异源表达.

西索米星生物合成基因sis I功能的研究

通过生物学试验,构建依纽小单孢菌TS388(Micromonospora inyoensis TS388)中sisI基因缺失工程菌,再通过分析其次级代谢产物的变化,揭示西索米星生物合成基因簇上sisI基因的功能.首先构建用于sisI基因框内敲除的穿梭载体pKTI3,经接合转移导入依纽小单孢菌TS388中,通过影印筛选及PCR鉴定获得sisI功能缺失工程菌TI1102(△sisI).工程菌经发酵,提取代谢产物,再经TLC及MS分析,用以比较亲株与工程菌代谢产物结构的差异.结果显示:工程菌TI1102代谢产物结构发生变化,不再合成西索米星,主要积累中间代谢产物JI-20A,由此证明了sisI基因参与了JI-20A到西索米星的3′,4′-双脱羟基作用.获得主产JI-20A的工程菌为该类半合成药物提供了重要前导化合物.