依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立

为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法。特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应。此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测。该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景。

沙门氏菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)检测体系,对沙门氏菌进行检测。采用沙门氏菌的invA基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测沙门氏菌的NAS-BA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为7.1×102cfu/ml,高于普通PCR方法。

溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)检测体系,对溶藻弧菌进行检测。采用溶藻弧菌的hsp60基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测溶藻弧菌的NASBA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为6.9×102 cfu.mL-1,高于普通PCR方法。溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法具有较高灵敏度和和良好特异性,并且对仪器要求更低,用普通恒温设备即可进行反应,具有广阔的推广前景。

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童支原体肺炎早期诊断及疗效判断中的价值

目的 考察实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期临床诊断中的价值及其在评价MPP转归以及判断药物疗效中的作用。方法 选取社区获得性肺炎(CAP)住院患儿451例,所有患儿在入院24 h内采集血清标本,采用被动凝集试验检测肺炎支原体(MP)特异性抗体[MP抗体检测(MP-Ab)],并采集咽拭子标本提取MP-RNA(MP-SAT法)。对MPP患儿在完成大环内酯类药物治疗第1疗程、完成大环内酯类药物治疗第3疗程时复查MP-Ab和MP-RNA。根据MPP诊断标准将其分为MPP组(n=183)和非MPP组(n=268)。比较MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。对病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物的MPP患儿进行动态观察,考察在大环内酯类药物(阿奇霉素)治疗MP不同时间点(入院时、完成第1疗程和完成第3疗程时)MP-SAT和MP-Ab的阳性率以及患儿临床和影像学表现(咳嗽、发热、肺部体征和CT表现)变化情况。结果 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性比较差异无统计学意义(P>0.05);病程<7 d患儿组中MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于MP-Ab(P<0.001或P<0.05或P<0.01)。病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物治疗的MPP患儿共42例,该组患儿在入院时、完成阿奇霉素治疗第1疗程和完成阿奇霉素治疗第3疗程时,MP-SAT检测阳性率分别为88.09%(37/42)、88.09%(37/42)和9.52%(4/42);MP-Ab检测阳性率分别为26.19%(11/42)、100.00%(42/42)和100.00%(42/42),在不同时间点MP-SAT和MP-Ab阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。该组患儿完成第3疗程时MP-SAT阳性率较入院时明显下降(P<0.001),临床症状(咳嗽、发热)、肺部体征及肺部CT表现较入院时明显好转(均P<0.001),MP-SAT结果与临床症状、肺部体征及肺部影像学表现变化趋势相一致。结论 SAT检测MP-RNA可作为儿童MPP的早期诊断依据,同时也可作为评价MPP转归及判断临床治疗效果的指标。

EasyNAT-pure20M联合恒温扩增-核酸试纸条法检测结核病的应用评价

目的评价EasyNAT-pure20M联合恒温扩增-核酸试纸条法(简称“TB-CPA法”)对肺结核诊断的效果,评估TB-CPA法在基层实验室检测结核病的应用价值。方法收集2020年至2021年应用“TB-CPA法”的4个县(区)疑似肺结核患者419例,其中男294例,女125例,平均年龄13~93岁,年龄中位数M(Q1,Q3)为60(44,70)岁。对419份痰液标本分别进行涂片抗酸染色镜检、罗氏固体培养基培养以及TB-CPA法检测。以培养结果为对照,评价TB-CPA法检测结核的灵敏度和特异度。结果以罗氏培养法为对照,评价EasyNAT-pure20M联合恒温扩增核酸试纸条法的检测效能,敏感度为83.48%、特异度为93.42%,阳性预测值为82.76%,阴性预测值为93.73%;在涂阴患者中,TB-CPA敏感度为66.67%、特异度为95.59%,阳性预测值为64.86%,阴性预测值为95.92%;在使用TB-CPA分子检测方法后,区域病原学阳性率从54.25%提升至65.65%。结论EasyNAT-pure20M联合恒温扩增核酸试纸条法在基层实验室具有应用价值,有助于提高病原学阳性率。

志贺氏菌基于核酸序列恒温扩增检测方法研究

使用自行建立和优化的基于核酸序列恒温扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification,NASBA)检测体系,对志贺氏菌(Shigella spp.)进行检测。采用志贺氏菌的ipaH基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测志贺氏菌的NASBA检测法,并进行特异性和灵敏度试验。结果表明:该检测方法具有较高的灵敏度和可靠的特异性,灵敏度为6.3×102cfu/mL,高于普通PCR方法。

花鲈虹彩病毒交叉引物恒温扩增检测方法的建立

【目的】花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)严重威胁花鲈养殖业安全,无特效防控药物,早期诊断在LMIV防控中发挥极其重要的作用。建立一种简便、快捷、准确的现场快速诊断方法,可为LMIV的基层诊断提供技术支撑。【方法】利用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA),针对LMIV ATPase基因高保守区设计1套单交叉引物。以构建的ATPase重组质粒作为阳性模板,对反应体系中的引物浓度比,Bst DNA聚合酶、Betaine、MgSO_(4)、dNTP浓度,以及反应温度和反应时间进行优化;结合一次性核酸试纸条,建立可视化检测LMIV-CPA的方法。【结果】最优引物浓度比组合为交叉引物CPF1.0μmol/L,引物F3和B3均为0.4μmol/L,探针引物B1(FAM)和B2(Biotin)均为0.8μmol/L;MgSO4浓度为6 mmol/L、Betaine浓度为0.4 mol/L、dNTP浓度为0.6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为0.256 U/μL;最佳反应温度为62℃,最佳反应时间为45 min。扩增产物经凝胶电泳检测呈梯形条带,带有探针的反应产物采用一次性核酸试纸条检测装置进行检测,在3~5 min内即可通过是否出现特征性条带而使反应结果可视化。该方法可特异性地检测出LMIV,不与其他水生常见病毒和常见细菌发生交叉反应。使用LMIV-CPA方法和常规PCR方法共同检测156份临床样品,LMIV-CPA的阳性检出率为93.30%,常规PCR方法的阳性检出率为85.83%;在比较二者的灵敏度差异时,LMIV-CPA的检测限为102 copies/μL,灵敏度为常规PCR的10倍,综合结果显示LMIV-CPA优于PCR。【结论】LMIV-CPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于LMIV的现场快速检测,为花鲈LMIV的准确快速诊断和有效防控提供技术支撑。

核酸序列依赖扩增联合分子信标对曲霉菌感染的检测效果

目的建立快速、灵敏、特异的定量检测曲霉菌感染的诊断方法。方法以烟曲霉菌、黄曲霉菌及黑曲霉菌的孢子配制菌液,提取RNA后,采用核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)联合分子信标(molecular beacon,MB)技术进行荧光检测,并对该方法进行灵敏度和特异性分析。结果扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与标本中霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-10.7x+81.6,r=0.988)。将含有梯度数量霉菌孢子的标本提取总RNA后进行检测,可建立相应标准曲线。该方法的灵敏度可达到1个孢子;对照菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌)与曲霉菌提取总RNA经扩增后的产物进行电泳分析,发现仅曲霉菌出现特异性条带。结论 NASBA结合分子信标检测曲霉菌具有灵敏度高、特异性强的特点,具有潜在利用价值,有望成为曲霉菌感染的临床诊断方法。

核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)概述

随着分子牛物学技术的快速发展,体外核酸扩增技术己逐步应用于科研和临床.最近几年才兴起的核酸序列依赖性扩增法(Nuleic and sequerce based amplipicain,NASBA)同传统的实验方法相比有灵敏性高,特异性强,快速,高通量等优点,而倍受中外学者的青睐.本文就NASBA方法作一综述.……

核酸依赖性扩增技术研究现状及展望

自19世纪90年代以来,等温核酸扩增技术及其衍生技术迅速发展。等温核酸扩增技术的流程简易、成本和应用要求更低,应用前景广泛。其中,核酸依赖性扩增技术(NASBA)已广泛用于病原体检测、单核苷酸突变检测和环境监测等领域。本文主要对近5年来NASBA技术的研究进展及其在分子诊断中的应用进行综述,探讨NASBA技术的前景与瓶颈。

恒温扩增核酸仪校准方法

介绍了恒温扩增核酸分析仪的工作原理。根据仪器的性能提出了该仪器的校准项目和技术指标:温度示值误差、温度均匀度、温度波动度、样本检测重复性、荧光强度或浊度检测重复性和荧光强度或浊度线性;重点探讨了仪器计量指标的校准方法,形成了一套系统的恒温扩增核酸分析仪校准方法,并对恒温扩增核酸分析仪进行了实际校准。结果表明,该方法科学合理、简便易行,可操作性强,可用于评价仪器计量性能,为仪器日常的校准工作以及国家计量校准规范的制定奠定了基础。

发酵乳中植物乳杆菌依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

通过依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)技术建立一种快速检测发酵乳中植物乳杆菌的方法。根据植物乳杆菌scrB基因序列(基因号为AJ579541.1)设计特异性引物,通过实验筛选出检测体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的较优含量,达到最优反应条件。所建立的HDA方法通过人工添加植物乳杆菌确定检出限,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过扩增产物电泳和序列比对分析验证方法一致性和稳定性。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中植物乳杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的适宜添加量分别为0.15μg和5.0μg,特异性良好,与涉及的其他菌株均未发生扩增,检出限为2.8×10^(1) CFU/g,扩增序列与设计序列长度(273 bp)一致且序列同源性为100%;本研究建立的方法可以快速检测发酵乳中植物乳杆菌,具有灵敏度高、操作简单、应用前景广等特点。

依赖核酸序列扩增技术检测呼吸道合胞病毒方法的建立

目的建立依赖核酸序列扩增技术(NASBA)检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法。方法依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库,利用Primer 5软件进行RSV特异性引物设计。收集经免疫荧光法检测确认RSV阳性的咽拭子样本,以同批检测RSV阴性样本作为阴性对照。优化样本处理条件和扩增反应体系,建立NASBA检测RSV的方法,并与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行比较。结果采用直接冻融法处理咽拭子样本,取上清检测;引物设计原则为引物加T7启动子序列。NASBA在RSV RNA标准品浓度为2.81×102拷贝/μL时仍能检测出目的片段,而RT-PCR在2.81×104拷贝/μL时目的条带隐约可见,提示NASBA的灵敏度比RT-PCR高出至少100倍。NASBA在7例RSV阳性咽拭子样本中特异性扩增出RSV RNA,而在其他病毒阳性(包括流感病毒A阳性2例、副流感病毒3阳性2例、腺病毒阳性1例)及RSV阴性(3例)样本中未见目的条带,提示NASBA的特异性较高。结论建立的NASBA特异性强、灵敏度高、耗时相对较短,克服了目前实验室病毒检测方法的局限性,为RSV的检测提供了有效的实验室检测手段。

设计特定序列的引物提高依赖解旋酶恒温扩增效率

依赖解旋酶恒温扩增(helicase-dependent amplification,HDA)是一种新型的恒温DNA体外扩增方法,具有反应原理简单,反应温度恒定等优点,被广泛地应用于核酸分子检测。但是依赖解旋酶恒温扩增仍面临着双链DNA解旋反应效率不高导致的扩增效率不够高、灵敏度低的问题。为了进一步提高依赖解旋酶恒温扩增技术中双链DNA模板的解旋效率,在本研究中,5'端带有不同长度不同序列的寡聚核苷酸引物,被用于依赖解旋酶恒温扩增反应,以研究DNA片段的末端序列对依赖解旋酶的双链DNA解旋反应,乃至整个扩增反应效率的影响。结果表明,只有5'端带有poly(A)序列的核酸引物明显促进了扩增反应效率,其中6个A的长度的5'端组成的引物对恒温扩增的促进作用最好,扩增产物比不带任何特定序列的原引物提高了约5.3倍。相比之下,带有poly(AC)或者poly(C)序列的引物,在一定程度上阻碍依赖解旋酶恒温扩增反应效率。因此,本研究证明了特定设计的末端序列,可以提高依赖解旋酶恒温扩增反应效率。

实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的价值研究

探讨实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的价值。方法 此次研究期间,对于所有的泌尿生殖道生殖支原体感染检测患者500例均以随机原则抽选自我院;选择时间下限为2021年4月,选择时间上限为2022年5月;其中230例为女性标本;270例为男性标本;对于所有患者有无呈现出支原体感染情况合理开展实时荧光核酸恒温扩增技术检测工作。之后就淋病奈瑟菌检测结果、沙眼衣原体检测结果以及解脲脲原体结果合理实施分析。结果 对于所有的泌尿生殖道生殖支原体感染检测患者500例均以随机原则抽选自我院;其中230例为女性标本;270例为男性标本。500例样本中,最终显示为阳性结果共计35例;其中男性标本共计23例,女性标本共计12例;同女性标本阳性率展开比较,男性标本阳性率存在有意义的差异(P<0.05)。对于本次研究的500例患者,进行尿液标本采集患者305例,对具体情况展开分析,25例所得结果为阳性;对于190例患者临床合理采集其分泌物标本,对结果展开分析,9例为阳性;5例患者同时对其展开尿液标本采集以及分泌物采集工作;1例获得阳性结果;阳性支原体感染患者共计35例,分别为23例男性以及12例男性。对应的单纯支原体感染例数分别为15例以及3例。男性单纯支原体感染患者比例较于女性单纯支原体感染患者比例更高(P<0.05);而对于阳性支原体感染患者共计35例,对于年龄≤20岁患者呈现出最高的感染率。以>20~30岁年龄段次之。在年龄逐渐增长后,对应的支原体感染率呈现出明显降低,存在有意义的差异(P<0.05)。结论 临床对于泌尿生殖道生殖支原体感染在实施诊断期间,实时荧光核酸恒温扩增技术呈现出较高的一致性,获得的临床效果较好。

核酸序列依赖性扩增、Real-time PCR及GM试验诊断侵袭性曲霉菌感染的临床应用评价

目的核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）、Real-time PCR及GM试验在侵袭性曲霉菌感染中的诊断价值。方法收集2013年11月~2014年6月临床上曲霉菌感染高危病患的血液标本80例,并根据EORTC/MSG诊断标准分为确诊组8例,拟诊组26例,非感染组46例,分别利用NASBA、real-time PCR及GM试验进行检测,计算3种方法的诊断指标并分析评价。结果 NASBA、real-time PCR及GM试验3种方法的灵敏度分别为76.47%、67.65%、52.94%,特异度分别为80.43%、89.13%、80.43%。联合诊断结果显示,NASBA与real-time PCR串联方案有最好的特异度（100%）及阳性预测值（100%）;NASBA与real-time PCR并联方案则最为灵敏（94.12%）。结论 NASBA用于诊断IA最为敏感,而real-time PCR则最为特异,GM试验的表现差于前两者。联合应用的诊断策略,在特定情况下提高临床早期诊断IA的准确性。

基于核酸序列依赖性扩增反应比色法检测沙门氏菌

本文以食源性致病菌中危害居于前列的沙门氏菌侵袭蛋白A基因作为检测靶标,通过改进传统的核酸序列依赖性扩增反应,开发了针对长链DNA的纳米金比色检测方法。本方法利用限制性内切酶和连接酶将T7启动子和终止子序列连接至靶标序列上,形成小型环状双链DNA,在T7 RNA聚合酶的作用下,转录出大量单链RNA序列进行NASBA反应,反应终产物能够促发纳米金探针发生交联聚集,溶液颜色从红色变成蓝色,从而实现对沙门氏菌的定量分析。

纳米金探针液相杂交法检测核酸序列依赖扩增产物诊断侵袭性曲霉病

目的建立纳米金探针液相杂交法检测核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)产物,用于快速诊断侵袭性曲霉病(IA)。方法采用NASBA扩增曲霉菌属特异性18S rRNA保守序列,扩增产物与5'端经巯基化俢饰的特异性纳米金探针进行液相杂交,用该法检测106例临床血液标本(14例确诊,32例拟诊,60例未感染IA),并与GM试验结果进行比较以评价该方法的准确性。结果纳米金探针只与曲霉菌属菌株的NASBA产物出现阳性杂交反应,而其他非曲霉菌均为阴性。NASBA-纳米金液相杂交法检测106例临床标本的敏感性和特异性分别为82.61%(38/46)、81.67%(49/60),ROC曲线下面积(AUC^(ROC))为0.890。GM试验检测的敏感性和特异性分别为56.52%(26/46)和83.33%(50/60),AUCROC为0.723。结论 NASBA-纳米金液相杂交技术检测曲霉菌感染具有敏感性高、特异性强、操作简单的特点,适合实验室常规开展。

核酸序列依赖扩增技术检测隐球菌的方法建立和评价

目的:建立核酸序列依赖扩增技术(NASBA)检测隐球菌RNA的方法,提高隐球菌感染诊断的准确性。方法:设计一对具有隐球菌属特异性的引物,构建NASBA扩增隐球菌RNA的方法并评价该方法的灵敏度和特异性。按欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG)2008年修订的侵袭性真菌病定义标准收集隐球菌感染的阳性病例和排除隐球菌感染的阴性病例,分别应用隐球菌荚膜多糖抗原检测(胶体金法)、PCR及本研究建立的NASBA方法进行检测。应用配对诊断试验设计、McNemar检验分别对3种方法进行比较以评价其诊断效能。结果:NASBA产物电泳结果显示仅新型隐球菌RNA扩增产物出现了特异性条带,而其他对照菌(烟曲霉、串珠镰刀菌、金黄色葡萄球、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌)均没有出现电泳条带;NASBA结合电泳检测结果表明该方法灵敏度可达10 cfu/mL。NASBA、荚膜多糖抗原胶体金法及PCR灵敏度分别是87.5%(95%CI=66.53%~96.71%)、100%(95%CI=82.83%~100%)、66.67%(95%CI=44.69%~83.57%),特异性分别是94.59%(95%CI=80.47%~99.06%)、81.08%(95%CI=64.29%~91.44%)、78.37%(95%CI=61.34%~81.58%)。结论:应用NASBA检测隐球菌RNA具有快速、准确高、操作简便的优点。并且整个实验过程无须特殊仪器,适合在普通的临床实验室开展,有望成为新的隐球菌感染的常规诊断方法。

NASBA(核酸序列依赖的扩增)及其在医学上的应用

NASBA（Nucleicacidsequence－basedamplification）即核酸序列依赖的扩增，是一种扩增RAN的新技术，是由一对引物引导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42℃进行，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍，不需特殊的仪器。本文就NASBA的原理、特点及实际应用作了介绍。